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第1讲基因工程•[最新考纲]1.基因工程的诞生(Ⅰ)2.基因工程的原理及技术(含PCR技术)(Ⅱ)3.基因工程的应用(Ⅱ)4.蛋白质工程(Ⅰ)•1．基因工程的基本工具•(1)两种工具酶：限制性核酸内切酶(限制酶)、DNA连接酶。限制性核酸

内切酶主要从原核生物中提取，具有专一性，使特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。•(2)一种运输工具：载体。•①载体的种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。•②四个条件：能够自我复制、有多个限制酶切割位点、具有标记基因、对受体细胞无伤害。•2．基因工程

的基本操作程序的四个主要步骤•目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定。•(1)基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。•(2)目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法。•(3)目的基因导入动物细胞的方法是显微注射法，

常用的受体细胞是受精卵。•(4)目的基因的获取与检测•①三种获取方法：基因文库直接获得、PCR扩增、人工合成。•②四种检测方法：DNA分子杂交、DNA—mRNA分子杂交、抗原—抗体杂交、个体生物学水平的抗性检测。•3．蛋白质工程是通过基因修饰或基因合成对现有蛋白质进行改造，或

制造一种新的蛋白质。•[课前导学]•1．基因工程的概念知识点一基因工程及基因工程的基本工具基因工程的别名基因拼接技术或__________技术操作环境__________操作对象基因操作水平__________水平基本过程剪切→______→______→表达结果人类需要的________

或生物类型优点①可________生物的遗传性状；②可克服远缘杂交不亲和性DNA重组生物体外DNA分子拼接导入基因产物定向改造•2．基因工程的基本操作工具•【答案】原核生物磷酸二酯键黏性末端磷酸二酯键

黏性末端平末端目的基因质粒自我复制•[小题通关]•1．(2018年广东对口升学模拟)限制性核酸内切酶MunⅠ和限制性核酸内切酶EcoRⅠ的识别序列及切割位点分别是—C↓AATTG—和—G↓AATTC—

。如图表示四种质粒和目的基因，其中箭头所指部位为限制性核酸内切酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是()•【答案】A•【解析】由图可知，质粒B上无标记基因，不适合作为载体；质粒C和D的标记基因上都有限制性核酸内切酶的识别位点。只有质粒A上既有标记基

因，且MunⅠ的切割位点不在标记基因上。•2．若要利用某目的基因(见图甲)和P1噬菌体载体(见图乙)构建重组DNA(见图丙)，限制性核酸内切酶的酶切位点分别是BglⅡ(A↓GATCT)、EcoRⅠ(G↓AATTC)和Sau3AⅠ(↓GATC)。下列分析合

理的是()A．用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体B．用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体•C．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体•D．用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体•【答案】D•【解析

】解答本题的关键是要看清切割后目的基因插入的方向，只有用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体，产生不同的黏性末端，可防止发生反向连接，这样构建的重组DNA中RNA聚合酶在插入的目的基因上的移动方向才一定与图丙相同。知识点二基因工程的基本操作程序及应用基因基因文库mRNA反转录D

NA合成仪PCR技术•2．基因表达载体的构建——基因工程的核心•(1)基因表达载体的组成：目的基因、启动子、终止子、___________等。•①启动子：•a．位置：位于_______________。•b．作用：是RNA聚合酶识别和结合的部

位，驱动基因________________，最终获得所需要的蛋白质。•②终止子：•a．位置：位于基因的尾端。•b．作用：使______在所需要的地方停止下来。标记基因基因的首端转录出mRNA转录•(2)构建的目的•①使目的基因在_____________

_中稳定存在，并且可以遗传给下一代；•②使______________能够表达和发挥作用。受体细胞目的基因稳定和表达农杆菌转化法花粉管通道法显微注射•4．目的基因的检测与鉴定方法检测或鉴定目的水平DNA分子杂交技术检测目的基因的有无______水平分子杂交技术检

测___________________________________技术检测目的基因是否翻译抗虫或抗病接种实验是否具有抗虫抗病特性个体水平目的基因是否转录分子抗原—抗体杂交•5．基因工程的应用•(1)植物基因工

程：主要用于提高农作物的___________，以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面。•(2)动物基因工程：主要应用于动物品种改良、建立生物反应器、______________等方面。•(3)基

因工程药物：来源于转基因的________。•(4)基因治疗：把__________导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能。抗逆能力器官移植工程菌正常基因•[小题通关]•1．下列有关基因工程的说法正确的是()•A．如果某种生物的cDNA文库中的某个基因与该生物的基因组文库中的某个基因控制的性状相

同，则这两个基因的结构也完全相同•B．一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子、终止密码子和标记基因•C．目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化•D．将目的基因导入植物细胞和动物细胞的常

用方法是显微注射法•【答案】C•【解析】cDNA是由mRNA反转录得到的，由于mRNA缺乏内含子和启动子，所以即使某生物的cDNA文库中的某个基因与该生物的基因组文库中的某个基因控制的性状相同，这两个基因的结构也可能是不相同的。基因表达载体包括启动子、目的基因、标记基因

、终止子，而终止密码子存在于mRNA上。将目的基因导入植物细胞通常用农杆菌转化法，导入动物细胞用显微注射法。•2．科学家将比目鱼的抗冻蛋白基因转移到西红柿细胞内培育出“抗冻西红柿”，在“目的基因的检测与鉴定”环节，不需要进行的是()•A．利用标记基因，将含

有比目鱼抗冻蛋白基因的西红柿细胞筛选出来•B．利用分子探针，检测“抗冻西红柿”的DNA上是否插入了抗冻蛋白基因•C．利用相应的抗体，检测“抗冻西红柿”细胞中是否形成抗冻蛋白质•D．进行抗寒栽培实验，检测“抗冻西红柿”是否能

在寒冷环境中生存•【答案】A••[课前导学]•1．概念理解•(1)基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。•(2)操作：___________或基因合成。•(3)结果：改造了现有蛋白质或制造出______________。•(4)目的：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对_________

_______进行分子设计。知识点三蛋白质工程基因修饰新的蛋白质蛋白质结构•2．蛋白质工程的设计流程•【答案】功能蛋白质结构氨基酸序列脱氧核苷酸序列•[小题通关]•(2018年河北定州期末)下列有关蛋白质工程的叙述错误的是()•A．蛋白质工程可合成自

然界不存在的蛋白质•B．蛋白质工程可对酶的催化活性、抗氧化性、热变性等加以改变•C．蛋白质工程是通过对基因的修饰或合成来实现对蛋白质的改造•D．蛋白质工程成功率低的原因主要是蛋白质种类太少，原料不足•【答案】D•【解析】蛋白质工程

可合成自然界不存在的蛋白质，A正确；蛋白质工程可对酶的催化活性、抗氧化性、热变性等加以改变，B正确；蛋白质工程是通过对基因的修饰或合成来实现对蛋白质的改造，C正确；蛋白质工程成功率低的原因主要是对蛋白质的空间结构了解过少，D错误。基因

工程的操作工具•(2)切割后产生末端的种类——黏性末端和平末端•①当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端。•②当限制酶在它识别序列的中轴线处切开时，产生的是平末端。•3．与DNA分子相关的几种酶比较

项目限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶作用底物DNA分子DNA分子片段脱氧核苷酸DNA分子作用部位磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键碱基对间的氢键作用特点切割目的基因及载体，能专一性识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条

链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键只能将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上将DNA两条链之间的氢键打开作用结果形成黏性末端或平末端形成重组DNA分子形成新的DNA分子形成单链DNA分子•4．

选择限制酶的注意事项(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。③为避免

目的基因和质粒的自身环化和随意连接，可使用两种不同的限制酶分别切割目的基因和质粒，如图甲可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种限制酶的切点)。•(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类•①切割质

粒的限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保具有相同的黏性末端。•②目的基因的表达需要调控序列，质粒插入目的基因部位之前有启动子，之后需有终止子。•③质粒作为载体必须具备标记基因、启动子和终止子等，选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标

记基因。•④如果所选限制酶的切点不是一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。•基因工程操作基本工具的8个易错点•(1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。•(2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或

强碱均易使之变性失活。•(3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。•(4)将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生4个黏性末端。•(5)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不

相同。•(6)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便进行检测。•(7)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通

透性有关。•(8)基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。•图1表示含有目的基因D的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ四种限

制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题：考查基因工程的操作工具•(1)图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由______________连接。•(2

)若用限制酶SmaⅠ完全切割图1中DNA片段，产生的末端是______末端，其产物长度为________________________________。•(3)若图1中虚线方框内的碱基对被T—A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合

子中分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有________种不同长度的DNA片段。•(4)若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是________________。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，

一般需要用添加__________的培养基进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是。•【答案】(1)脱氧核糖—磷酸—脱氧核糖•(2)平537bp、790bp、661bp(3)4•(4)BamHⅠ抗

生素B同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向连接•【解析】(1)两条脱氧核苷酸链之间的碱基通过氢键相连，一条脱氧核苷酸链中相邻的碱基通过“脱氧核糖—磷酸—脱氧核糖”连接。(2)根据限制酶SmaⅠ识别的碱基序列可知，限制酶SmaⅠ切割产生的末端为平末端。在图1序列中共有2个

SmaⅠ的切割位点，切割后形成3种不同长度的产物，分别为537bp、790bp、661bp。(3)图1中有SmaⅠ的两个识别序列，完全切割后产生3个不同长度的DNA片段，若虚线方框中的碱基对被T—A碱基对替换，再经SmaⅠ识别并完全切割后会产生2个DNA片段，其中1个DNA片段与未替换前

完全切割的相同，因此经完全切割后共产生4种不同长度的DNA片段。•(4)切割目的基因可选用限制酶BamHⅠ和限制酶MboⅠ，但限制酶MboⅠ可将质粒中的抗生素A抗性基因和抗生素B抗性基因都破坏，而限制酶BamHⅠ只破坏抗生素A抗性基因，

因此只能选用限制酶BamHⅠ；重组质粒中含有抗生素B抗性基因，因此可在含抗生素B的培养基上培养。基因工程的操作过程及蛋白质工程及其与基因工程的关系•2．基因表达载体的构建•(1)基因表达载体的组成及作用•(2)构建过程•3．将目的基因导入受体细胞的方法

比较项目植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射技术感受态细胞法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程将目的基因插入到Ti质粒的T－DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→

显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子•4．目的基因的检测与鉴定•5．蛋白质工程与基因工程的关系比较项目蛋白质工程基因工程区别

过程预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定实质定向改造或生产人类所需的蛋白质定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品结果可生产自然界没有

的蛋白质只能生产自然界已有的蛋白质联系①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程；②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造•基因工程中的3个易错点•(1)基因表达载体≠载体：基因表达载体与载体相比增加了目的基因。•(2)目的基因的插入位点不是随意的：基因表达需要启动

子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位，若目的基因插入到启动子内部，启动子将失去其功能。•(3)启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子：启动子和终止子位于DNA片段上，分别控制转录过程的启动和终止；起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。•

1．转基因草莓中有能表达乙肝病毒表面抗原的基因，由此可获得用来预防乙肝的一种新型疫苗，其培育过程如下图所示(①～④代表过程，A～C代表结构或细胞)：考查基因工程的操作过程(1)在图中①基因表达载体的构建过程中，为了使目的基因正常表达，目

的基因的首端必须有________识别和结合的部位。若选择的限制酶切出的DNA片段是平末端，应选择____________进行连接。•(2)将目的基因导入受体细胞的方法很多，在该题中涉及的方法是_______

_________，之所以要把目的基因插入Ti质粒的T－DNA中，这是利用T－DNA________________________________的特点。•(3)过程②的具体操作是：先用____________处理农杆菌，

使其处于感受态；再将含乙肝病毒表面抗原基因的重组Ti质粒溶于缓冲液中与经处理的农杆菌混合，完成转化过程。•(4)图中③和④过程分别叫作__________________，将叶盘培养成草莓幼苗所依据的原理是_______________

___________________。•(5)乙肝病毒表面抗原的基因能否在草莓植株体内维持稳定遗传的关键是_____________________，通常采用__________的方法进行检测。•【答案】(1)RNA聚合酶T4DNA连

接酶•(2)农杆菌转化法可转移至受体细胞并整合到受体细胞的染色体DNA上(3)Ca2＋•(4)脱分化和再分化植物细胞的全能性•(5)目的基因是否插入了受体细胞的染色体DNA上DNA分子杂交•【解析】本题考查基因工程及转基因生物的安全性的相关知识，

意在考查对基因工程的理解及运用所学知识解决实际问题和识图的能力。(1)基因表达载体由启动子、目的基因、终止子和标记基因等组成，其中启动子是RNA聚合酶识别和结合位点；根据酶的来源不同，DNA连接酶分为两类：E·coliDNA

连接酶和T4DNA连接酶，这二者都能连接黏性末端，但是T4DNA连接酶还可以连接平末端。(2)将目的基因导入受体细胞的方法很多，在该题中涉及的方法是农杆菌转化法。农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。•(3)图

中②过程是将重组质粒导入农杆菌，由于受体细胞是细菌，常用Ca2＋处理使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，称为感受态细胞，以完成转化过程。(4)图中③过程是让叶盘细胞脱分化形成愈伤组织，进而再经④再分化形成幼苗，此过程叫作植物组织培养；原理是植物细胞的全能性。(5)乙肝病毒表面抗

原的基因能否在草莓植株体内维持稳定遗传的关键是目的基因是否插入了受体细胞的染色体DNA上，通常采用DNA分子杂交的方法进行检测。在分子水平上，还可采用抗原—抗体杂交的方法来检测转基因草莓果实提取液中有无相应的抗原。•2．干扰素是动物体内合成的一种蛋白质，可以

用于治疗病毒感染和癌症，但体外保存相当困难，如果将其分子中的一个半胱氨酸变成丝氨酸，就可以在－70℃条件下保存半年，给广大患者带来了福音。•(1)蛋白质的合成是受基因控制的，因此获得能够控制合成“可以保存的干扰素”的基因是生产的关键，依据蛋白质工程原理，设计实验流程，

让动物生产“可以保存的干扰素”：考查蛋白质工程的应用•(2)基因工程和蛋白质工程相比较，基因工程在原则上只能生产________________的蛋白质，不一定符合________________的需要。而蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其与生物功

能的关系为基础，通过_______或_______，对现有蛋白质进行_______，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活需要。•(3)蛋白质工程实施的难度很大，原因是蛋白质具有十分复杂的________结构。

•(4)对天然蛋白质进行改造，应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？•______________________________________________________________。•原因是_______________________

___________________________。•【答案】(1)预期的蛋白质功能预期的蛋白质结构应有的氨基酸序列相对应的脱氧核苷酸序列(基因)•(2)自然界已存在人类生产和生活基因修饰基因合成改造•(3)空间(或高级)•(4)应该从对基因的操作

来实现对天然蛋白质的改造首先，任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因也就是改造了蛋白质，并且改造过的蛋白质可以通过改造过的基因遗传给下一代。如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造过的蛋白质分子还是无法遗传；其次，对基因进行改造比对蛋白质直接进行改造要容易

操作，难度要小得多•【解析】(1)蛋白质工程的基本流程为根据预期的蛋白质功能，设计出预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，合成相对应的脱氧核苷酸序列。(2)蛋白质工程的实质是通过对基因改造或基因合成，制造自然界不

存在的、符合人们生产和生活需要的蛋白质。(3)蛋白质的空间结构十分复杂，很难根据预期功能来预测出空间结构。(4)基因控制蛋白质的合成，对基因的改造相当于间接改造了蛋白质。