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HBVDNA检测在乙肝治疗中的应用罗氏诊断产品（上海）有限公司王亚雄2006年8月11日上海HBVDNA检测在乙肝治疗中的应用1为什么进行HBVDNA检测HBVDNA检测带给我们的益处目前HBVDNA

的检测方法罗氏COBASAmplicor系统的优点新一代技术COBASTaqMan主要内容HBVDNA检测在乙肝治疗中的应用2乙型肝炎：全球性的健康问题•目前HBV携带者超过350million•25–40%HBsAg阳性人群会死于肝硬化或肝癌•全

球350millionHBV携带者,75%在亚洲HBVDNA检测在乙肝治疗中的应用3中表面抗原（S+preS2）核蛋白壳HBcAg(HBeAg)DNA聚合酶膜蛋白基因组DNA小表面抗原HBsAg(S)RNA引物大表面抗原（S+preS2+preS1

)乙肝病毒颗粒示意图HBVDNA检测在乙肝治疗中的应用4慢性乙肝检测指标•HBsAg–确定慢性乙肝•HBeAg/anti-HBe–区分感染的不同时期•HBV聚合酶–检测病毒的酶活性•HBVDNA–检测病毒载量(病毒转录活性)•HBcAg–检测病毒蛋白(病毒翻译活性)

HBVDNA检测在乙肝治疗中的应用5HBV病毒基因HBVDNA检测在乙肝治疗中的应用6慢性乙型肝炎暴露后时间滴度ALTAnti-HBcSymptoms560123467123458910HBsAgHBeAg月年H

BVDNAAnti-HBeHBVDNA检测在乙肝治疗中的应用7慢性乙肝的三种临床表现•HBeAg阳性慢性乙肝HBeAg,ALT升高,HBV-DNA107to1011拷贝每毫升，病理切片指征明显•HBeAg阴性慢性乙肝Anti-H

Be,ALT升高，HBV-DNA104to108拷贝每毫升,病理切片指征明显•HBsAg阴性携带期Anti-HBe,ALT正常,HBV-DNA<101to104拷贝每毫升,病理切片变化极小EASL（欧洲肝病学会）将显著的复制水平定为HBV-DNA105拷贝每毫升HBVDNA检测在

乙肝治疗中的应用8•HBV保持复制活性（HBVDNA≥105copies/mL）,转氨酶3－6月内持续升高，建议进行治疗•对于e抗原阳性的慢性乙肝患者而言，采用干扰素治疗结束后，应该检测e抗原、e抗体和HBVDNA水平，并且每6个月评估病

毒学反应•对于e抗原阴性的慢性乙肝患者而言，在经过抗病毒治疗后，检测血清HBVDNA水平是评估病毒学反应的唯一方式欧洲肝病学会（EASL）2003乙肝防治指南HBVDNA检测在乙肝治疗中的应用9•HBV-DNA血清阳性病人，如果ALT>2ULN,要考虑治疗•治疗期间，ALT、e抗原和HBV-DNA

至少每3个月检测一次亚太乙肝防治共识2003JournalofGastroenterologyandHepatology(2003)18,239–245HBVDNA检测在乙肝治疗中的应用10•抗病毒一般适应症主

要指标：HBVDNA≥105拷贝/mL•病毒学应答重要指标包括血清HBV，DNA检测不到(PCR法)或低于检测下限，或较基线下降≥2log10中华医学会肝病学分会/中华医学会感染病分会－慢性乙肝防治指南HBVDNA检测在乙肝治疗中的应用11为什么进行HBVDNA检测HBVDNA检测带

给我们的益处目前HBVDNA的检测方法罗氏COBASAmplicor系统的优势新一代技术COBASTaqMan主要内容HBVDNA检测在乙肝治疗中的应用12HBVDNA检测带给我们的益处•监测抗病毒治疗效果•早期确定病毒学应答预测治疗后反应(HBsAg消失)•预测耐药突变

•预测肝移植后复发•检测HBsAg携带者的病毒的活动情况HBVDNA检测在乙肝治疗中的应用13指标正常/HBeAg阳性(n.31)anti-HBe阳性(n.15)转阴ALT127HBeAg12NDdot-blothybridization.127IgManti-HBcND5Am

plicorHBVMonitor52HBsAg32经治疗生化指标正常病人中病毒清除率HBVDNA检测在乙肝治疗中的应用14治疗中/后，应答者与不应答者HBVDNA水平的比较1x1021x1041x1061x1081x1010HBVDNAlevelscopies/mlmean±SEMp=0.07p=

0.2p<0.01p<0.001p<0.001p<0.001p<0.001p<0.001p<0.001-不应答者--应答者-治疗中治疗后HBVDNA检测在乙肝治疗中的应用15监测抗病毒治疗，预测耐药Puchhammer-

StocklE.atal.JInfectDis181:2063,2000HBVDNA检测在乙肝治疗中的应用16HBVDNA载量显示携带者处于活动或非活动状态HBVDNAcopies/mlManesisK.etal.Gastroenterology122(7):2092-3,20

02.1.E+021.E+031.E+041.E+051.E+061.E+071.E+081.E+09非活动状态活动状态HBVDNA检测在乙肝治疗中的应用17HBVDNA载量在肝移植中的应用•在肝移植中(LiverT

ransplantation)为防治肝移植后的复发所采取的预防性治疗需要达到HBVDNA<104copies/mL的指标HBVDNA检测在乙肝治疗中的应用18为什么进行HBVDNA检测HBVDNA检测带给我们的

益处目前HBVDNA的检测方法罗氏COBASAmplicor系统的优势新一代技术COBASTaqMan主要内容HBVDNA检测在乙肝治疗中的应用19目前HBVDNA的检测方法•罗氏COBASAmplicorHBVMonitor•Dig

eneHybridCapture杂交捕捉•AbbottGenostix已消失•BayerbDNA3.0•国产HBVDNA检测试剂及方案•罗氏COBASTaqManHBVmonitorHBVDNA检测在乙肝治疗中的应用20灵敏度比较TechnologyLODcopies/mLR

ocheAMPLICOR300DigeneHybridCapture~140,000AbbottGenostix~500,000BayerbDNA3.0~2,000RocheCobasTaqman~35国产试剂？HBVDNA检

测在乙肝治疗中的应用21BranchedDNA(bDNA)HBVDNA检测在乙肝治疗中的应用22靶探针*Preamplifier*Microwell靶DNA捕获探针微孔板捕获探针Amplifier*withhybridizedLabelProbes**component

scontainingIso-C/Iso-G»信号扩增BranchedDNA(bDNA)HBVDNA检测在乙肝治疗中的应用23国内Realtime方法HBV的检测现状HBVDNA检测在乙肝治疗中的应用24PCR反应M

g2+dCTPdGTPdUTPdATPTaqDNAPolymeraseAmpErase®TargetDNAHBVDNA检测在乙肝治疗中的应用25模板扩增1cycle=22cycle=43cycle=84cycle=165cycle=326cycle=64

7cycle=128SinglestrandRNAHBVDNA检测在乙肝治疗中的应用26水解探针(TaqMan)模式淬灭基团报告荧光激发荧光淬灭激发荧光检测到信号HBVDNA检测在乙肝治疗中的应用27实时荧光定量模式0510152025300102030405060相对荧光强度None1Thre

sholdCycleThreshold(Ct)for108C/PCRHBVDNALogC/PCR2876543循环数HBVDNA检测在乙肝治疗中的应用28需要关注的国内实时荧光PCR检测的问题•仪器90％源于进口，ABI、R

OCHE、Bio-Rad…•试剂100％国产，匹基、达安、科华、复星…HBVDNA检测在乙肝治疗中的应用29需要关注的国内实时荧光PCR检测的问题•目前国内使用的进口RealtimePCR仪全部是针对科研用途研发的，缺乏临床诊断所需的质控

系统•所有进口PCR仪均为开放系统，除Roche外均不提供临检用试剂•仪器厂家仅负责仪器运行是否正常，不对检测结果做任何保障HBVDNA检测在乙肝治疗中的应用30•均采用外部标准曲线定量，标准品为重组质粒，与临床标本有无差异－－？•质控品及标准品有无朔源性－－？•试剂是否标明“域值”

或“CrossBand”取值范围－？•阳性质控是否给出标准值范围－－？•标准品浓度是否覆盖声明的检测灵敏度－－？•是否提供内部质控品－－？•纯化产率如何控制－－？需要关注的国内实时荧光PCR检测的问题HBVDNA检测在乙肝治疗中的应用31检测结果标准化的问题标准化的各要素校准品试剂分析仪HB

VDNA检测在乙肝治疗中的应用32为什么进行HBVDNA检测HBVDNA检测带给我们的益处目前HBVDNA的检测方法罗氏COBASAmplicor系统的优点新一代技术COBASTaqMan主要内容HBVDNA检测在乙肝治疗中的应用33COBASA

mplicor检测原理杂交(37PCR扩增变性杂交清洗加AV-HRP加TMBHBVDNA检测在乙肝治疗中的应用34内部标准品(QS)全程监控样本制备/PCR过程兼作定量参照BBBB内部标准品DNA模板DNA模板DNA内部标准品DNACOBA

SAmplicor：与固定在磁珠上的探针杂交内对照防止假阴结果，精确定量PCRHBVDNA检测在乙肝治疗中的应用35COBASAMPLICORHBVMonitor特点•检测下线300copies/mL,>95%检出率•线性范围300-200,

000copies/mL•同等定量亚型A-F•血清或血浆•100ul样本•6小时检测时间,30分钟手工准备•内部定量标准•防污染系统HBVDNA检测在乙肝治疗中的应用36COBASAmplicorVSbDNAHBVDNA检测在乙肝治疗中的应用37COBASAmplicorvsbDNA

HBVDNA检测在乙肝治疗中的应用38COBASAmplicorvsbDNACobasAmplicorbDNA标本准备乙醇沉淀磁珠吸附扩增靶序列光信号线性范围300－200,0002000-100,000,000

特异性100%99.2%（96-98%)亚型A－FA－F污染控制有无定量方案内部标准品外部标准曲线Control数量3个12个报告时间8小时24小时HBVDNA检测在乙肝治疗中的应用39COBASAmplicorH

BV灵敏度vs其它测试?-预测反跳？-预测突变？-预测肝移植复发风险？其他测试的灵敏度COBASAmplicorHBV灵敏度1101001,00010,000100,0001,000,00010,000,0

00100,000,000048122024WeeksoftherapyHBVDNAcopies/mLHBVDNA检测在乙肝治疗中的应用40为什么进行HBVDNA检测HBVDNA检测带给我们的益处目前HBVDNA的检测方法罗氏COBASAm

plicor系统的优势新一代技术COBASTaqMan主要内容HBVDNA检测在乙肝治疗中的应用41COBASTaqMan实时荧光检测系统HBVDNA检测在乙肝治疗中的应用42COBASTaqMan特点及益处•动态PCR•整合定量标准，不需外标准曲线•检测管封闭，无需开盖•四色

荧光通道(计划升级到六色)•检测管:k-tubeork-plate•宽广的动力学范围•连续检测•检测时间从6小时减少到2～3小时•增加通量•提供内质控•减少污染风险•允许多重PCR靶标检测•可用于其他检测模式(杂交探针)•处理过程简单•可与AmpliPrep联用，实现自动化益处特点HBV

DNA检测在乙肝治疗中的应用43COBASTaqMan定量原理0510152025300102030405060相对荧光强度None1ThresholdCycleThreshold(Ct)for108C/PCRHBVDNALogC/PCR2876543循环数HBVD

NA检测在乙肝治疗中的应用44COBASTaqManHBV检测线性范围HBVDNA检测在乙肝治疗中的应用45COBASTaqManHBV检测各亚型表现HBVDNA检测在乙肝治疗中的应用46COBASTaqManHB

VTestvsCAHBMCOBASTaqManHBVTestCOBASAMPLICORHBVMonitorTestReportingUnitIU/mL(5.82copies/IU)Copies/mLLinearity6–1.1

0E8300–2.00E5SampleVolume500uL100uLTargetPre-core/CoreSameSampleTypeEDTAPlasma&SerumSameGenotypesA–G,pre-coremutantA-E,limitedF,GR

unSize48tests24testsSerialDilutionsNone1:10HBVDNA检测在乙肝治疗中的应用47感谢HBVDNA检测在乙肝治疗中的应用48