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TechniquesinNeurobiologyStateKeyLabofMedicalNeurobiology脑立体定位和切片技术TechniquesinNeurobiologyStateKeyLabofMedicalNeurobi

ology脑立体定位技术TechniquesinNeurobiologyStateKeyLabofMedicalNeurobiology脑立体定位技术的简单流程TechniquesinNeurobiologyStateKeyLabofMedic

alNeurobiology动物脑立体定位：利用颅骨的标志/参考点，确定皮层下某些神经结构的位置，利用脑立体定位仪对脑进行定向的刺激、破坏、药物注射、引导电位等研究的技术。主要用途：对神经结构进行定向的：注射（给药）埋管（慢性给药，透析）损毁记录（电生理）TechniquesinN

eurobiologyStateKeyLabofMedicalNeurobiology前囟（Bregma）：位于冠状缝和矢状缝的交界处人字缝尖（lambda）：位于后囟人字缝与矢状缝的交汇点TechniquesinNeurobiologyStateKeyL

abofMedicalNeurobiologyBregma,前囟TechniquesinNeurobiologyStateKeyLabofMedicalNeurobiology动物脑立体定位：利用颅骨的标志/参考点，确定皮层下某些神经结构的位置，利用脑立体定位仪对脑

进行定向的刺激、破坏、药物注射、引导电位等研究的技术。主要用途：对神经结构进行定向的注射（给药）埋管（慢性给药，透析）损毁记录（电生理）TechniquesinNeurobiologyStateKeyL

abofMedicalNeurobiologyKopf900StereotaxicKopf1404FrameAssembly立体定位仪：TechniquesinNeurobiologyStateKeyLabofMedica

lNeurobiologyStereotaxicDrillUnitAdjustableWireKnifeKopf5000MicroinjectionUnitTechniquesinNeurobiologyStateKeyLabofMed

icalNeurobiology立体定位仪：TechniquesinNeurobiologyStateKeyLabofMedicalNeurobiology游标卡尺原理根据游标上的分度格数，常把游标卡尺分为10分度、20分度、50分度。尺身上的最小分度是1毫米，游标尺上有10个小的等分

刻度，总长9毫米，每一分度为0.9毫米，比主尺上的最小分度相差0.1毫米。尺身和游标的零刻度线对齐，它们的第一条刻度线相差0.1毫米。立体定位仪中坐标的读取主尺游标尺TechniquesinNeurobiologyStateKeyLabofMedicalNeurobiology游标卡尺按

下列规则读数：（1）以游标零刻线位置为准，在主尺上读取整毫米数。（2）看游标上哪条刻线与主尺上的某一刻线（不用管是第几条刻线）对齐，由游标上读出毫米以下的小数。（3）总的读数为毫米整数加上毫米小数。TechniquesinNeurobio

logyStateKeyLabofMedicalNeurobiology研究实例TechniquesinNeurobiologyStateKeyLabofMedicalNeurobiologyMFB:(1)AP:4.4mm,ML:1.2mm,V:7.8mm;

(2)AP:4.0mm,ML:0.8mm,V:8.0mm内侧前脑束（MFB）:从基底嗅区、旁杏仁核区和隔核出发投射至下丘脑侧部的一组复杂纤维。MFB的DA能神经纤维相对集中，相对小剂量的6-OHDA注入MFB能造成更多的DA能神经元死亡。Tec

hniquesinNeurobiologyStateKeyLabofMedicalNeurobiology[器材和药品]立体定位仪、10％水合氯醛麻醉剂、1ml注射器、手术刀、组织剪、止血钳、牙科钻或骨钻、金属定位针、脱脂棉花、3%双氧水（H2O2）、缝针与缝

线、75%酒精[实验动物]雄性SD大鼠，体重约200-300g实验准备TechniquesinNeurobiologyStateKeyLabofMedicalNeurobiology[操作步骤]1.立体定位仪的一般校验2.动

物麻醉：动物称重后，水合氯醛溶液按3.6ml/kg作腹腔注射麻醉。3.头部固定：（1）插入耳棒:先将一侧耳棒轻轻插入外耳道，碰到骨性外耳道底后固定耳棒，继之同样固定另一耳棒。检查大鼠头部固定是否稳定，松斜，两侧耳棒刻度是否

对称，轻移耳棒使两侧刻度一致，头位完全居中，再次固定耳棒。三个标准检测是否固定成功：鼻对正中，头部不动，提尾不掉（2）固定上颌：将大鼠的上门牙塞进上齿固定板的槽内，旋紧螺丝。从各方向推压动物头部，均不应出现移动。通过定位针的测量调节前后囟在同一矢状线上，并使前后囟在同一水平线上

。TechniquesinNeurobiologyStateKeyLabofMedicalNeurobiology4.开颅：剪去头部的毛，用碘酒与酒精棉球消毒头部皮肤，沿矢状缝作切口，剥离筋膜及肌肉，推开骨膜，暴露骨缝，并用3%双氧水洗净，止血。5.脑内核团定位:(1)

根据脑图谱，确定所要研究神经核团的立体位置（注意：所研究的脑核团距脑表面的距离和颅骨表面的距离）。(2)用定位针参照中线和前后囟在颅骨上标记进针的部位后，在指定位置钻孔。6.定位标记及组织学鉴定：(1)定位标记：根据定位坐标，插入微量注射针，注入染料。(2)组织学鉴定：动物处死后，大鼠用左心室

-主动脉插管，先后用生理盐水和4%多聚甲醛溶液灌流固定，取脑作冰冻连续切片，观察确定注射位置是否准确TechniquesinNeurobiologyStateKeyLabofMedicalNeurobiologyTechniquesinNeurobiologySta

teKeyLabofMedicalNeurobiologyTechniquesinNeurobiologyStateKeyLabofMedicalNeurobiology纹状体：前囟前1mm,旁开2.5mm,深3.5mm1.00实验内容TechniquesinNeurobio

logyStateKeyLabofMedicalNeurobiology切片技术TechniquesinNeurobiologyStateKeyLabofMedicalNeurobiology固定剂:理想的固定剂应能阻止组织自溶，保护组织免受微生物的作用，并能使

组织承受一定的渗透压的作用，维持组织结构的完整；能保存或至少部分保存组织的化学特性。常用的固定剂-----醛类。甲醛（formaldehyde）是醛类中最常用的;商品名为福尔马林（formalin）的试剂，约含37%的甲醛。4%多聚甲醛（

paraformaldehyde）也是常用的固定剂，在热水中可解聚为成甲醛单体，在接近水的沸点时溶解极快。戊二醛（glutaraldehyde）也是一种常用的固定剂。它的交链作用较甲醛强，反应快，但其对组织的穿透力较甲醛弱。切片的制备：固定TechniquesinNeu

robiologyStateKeyLabofMedicalNeurobiology切片方法：振动切片、石蜡切片、火棉胶切片、冰冻切片切片（Sectioning）4μm30μm恒冷切片机冰冻切片机冰冻切片：是神经形态学研究中常用的方法最主要的优点：快

速简便恒冷切片机切片和半导体制冷机切片脑片厚度：10~100微米TechniquesinNeurobiologyStateKeyLabofMedicalNeurobiology[器材和药品]器械：手术刀、组织剪、止血钳、咬骨钳、无齿钳、5ml注射器、6号针头、灌注瓶、恒冷

切片机/半导体制冷切片机液体：10％水合氯醛溶液、生理盐水、4％多聚甲醛溶液、20％蔗糖溶液、30％蔗糖溶液制备切片具体步骤：TechniquesinNeurobiologyStateKeyLabofMedicalNeurobiology[操作步骤]1.麻醉动物：在无

需特别考虑麻醉药影响的情况下，可深麻动物。2.组织固定：决定切片的质量固定方式－－浸泡固定和灌注固定灌注固定(1)剪开胸腔，暴露心脏(2)将注射针头插入左心室，减开右心耳(3)放松输液管夹，先用生理盐水冲去血液，直至右心耳流出液体清亮无色（

一般原则灌洗量不宜过多，灌洗时间不宜长，大鼠一般100ml）(4)换以固定液继续灌流，先快后慢，固定液的量，大鼠一般为300-500ml左右(5)开颅取脑，后固定、入蔗糖→切片生理盐水4%PATechniquesinNeurobiologyStateKeyLabofMedicalNeurobio

logy3.切片※切片刀的安置：刀的刃面与组织切面之间应有一定的角度，称为余隙角a。余隙角一般在2~5※组织冷冻程度：冷冻适度，过冷可致切片横向断裂、冷冻不足，切片容易厚薄不匀※切片：动作连贯Techniquesi

nNeurobiologyStateKeyLabofMedicalNeurobiology问题可能原因纠正操作切片厚薄不均：切片厚度时厚时薄，•刀片未正确夹紧•刀片变钝•刀片的倾斜角太小•重新夹紧刀片•侧向移动刀架或插入新刀片•依次增大角度设

置进行试验，直到找到最佳的角度切片压缩：切片压缩过度，出现皱褶或挤压•刀片变钝•样品温度太高•角度太宽•使用刀片的其它部位，或使用新刀片•切片前先冷冻样品•依次减小角度设置，直到找到最佳的角度切片出现划痕和颤痕•角度太宽•切片刀宽

窄不对•未夹紧样品夹系统和/或刀架•依次减小角度设置，直到找到最佳的角度•使用另一种宽度的切片刀•检查夹样系统和刀架上的所有螺丝和夹具。必要时拧紧锁杆和螺丝切片中常遇到的问题及解决方案：TechniquesinNeurobiologyS

tateKeyLabofMedicalNeurobiology半导体制冷仪TechniquesinNeurobiologyStateKeyLabofMedicalNeurobiology•每次写实验报告，交给下次上实

验课的老师。记平时成绩（占最后总成绩的20％）•下次实验课：时间：10月10日，星期六，上午九点开始地点：治道楼八楼会议室上课内容为：免疫组织化学ABC染色法TechniquesinNeurobiology

StateKeyLabofMedicalNeurobiologyThanks!