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引物设计原则及设计软件优选引物设计原则及设计软件PCR引物设计及相关软件使用→←SenseprimerAntisenseprimer选择模板序列保守区域1、引物设计原则引物长度碱基分布的均衡性Tm值引物二级结构引物3’端引物5’

端引物的内部稳定性自由能分布引物长度一般引物的长度为15-30bp，常用的长度为18-21bp。过长或过短都不合适，为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应，长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性，而

且比短序列杂交慢，从而降低了产量。引物过短会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp是必要的（18bp的序列在人类基因组中只会出现一次）。决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度Tm=（g+C）*4

+（a+T）*2同一碱基连续出现不应超过5个GC含量一般40-60%，以45-55％为宜•GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性•GC含量太高也易于引发非特异扩增。碱基分布的均衡性有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，导致引物的GC含

量不能在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近（上下游引物的GC含量不能相差太大），以有利于退火温度的选择。引物Tm值一般要求：55℃-65℃。应尽可能保证上下游引物Tm值一致，一般

差异控制在2℃以内。（引物的退火温度相差小于5℃一般不会影响PCR的产率，理想情况下一对引物的退火温度是一样的，可以在55℃～80℃间变化，有说接近72℃为最佳）上下游引物Tm值与产物Tm值一般应控制在20℃以内。一般采用较

低引物Tm值-5℃作为PCR退火温度。一对引物的GC含量和Tm值应该协调。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴。若G+C含量太低，可在5'端加上一些G或C，若G＋C含量太高，可在5'端加上一些A或T。引物二级结构引物二聚体（引物间不应多

于4个连续碱基的同源性或互补性）•尽可能避免两个引物分子之间3’端有较多碱基互补发夹结构（引物自身连续互补碱基不能大于3bp）•尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则将严重影响DNA聚合酶的延伸。（两项结构的能值以

不超过4.5为好，引物中间或5’端可适当放宽）两引物之间不应该存在互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一般情况下，一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。引物3’端引物的延伸从3’端开

始，因此3’端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增完全失败。引物3’端的碱基一般不用A（3’端碱基序列最好是G、C、CG、GC）。另外引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。3’端的连续3个G或C，如GGG或CCC

，会导致引物在G+C富集序列区错误引发引物5’端引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基（对PCR影响不大），常在5’端引入修饰位点或标记物。•5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5’端加上适当数量的保

护碱基）。•5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。•5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。双酶切位点，有利于定向克隆，2-3个保护碱基，一般加CG。计算引物Tm值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。引物

的内部稳定性过去认为，引物3’端应牢牢结合在模板上才能有效地进行延伸，故3’端最好为G或C。现在的观点认为，引物的5’端应是相对稳定结构，而3’端在碱基配对的情况下最好为低稳定性结构，即3’端尽可能选用A或T（有说不适宜用A），少用G或C。若模板

不很清楚，引物3’端最后一个碱基最好为T，其次是G或C，而不选A，国外资料表明，当末位为T时，即使在错配的情况下也能引发链的合成，而末位为A时，错配时引发大大降低，G或C居中，可见，模板很清楚时选A可以提高特异性。2、师补充：维生素、无机盐、有机酸、芳香

物质、少量脂肪……5在电汽车遇到地震怎么办？3、教师小结：通过这一件小小的事情，他说：“你们公司能把事情考虑得这么细，买车以后，我还有什么不能相信你们的地方呢？”回避问题的应聘者：这位应聘者的神色表明他很不自在。他的身体和双腿姿势僵硬。他摆弄着手指，眼光游移不定，避免与面试者目

光相遇。（摆弄手指；两腿姿势僵硬。）第二课时摔伤碰破后的救护1．常见问题各国对招聘广告的限制不尽相同。不过大多数国家都禁止在广告上出现诽谤性文字和有关性别、种族或年龄方面的歧视性文字。在广告行文中避免使用诸如“他”之类的性别歧视语言。这方面的

措辞须谨慎才好，否则可能会将不同性别、种族和特定年龄段的潜在应聘者拒之门外。如有疑问，可请教律师。全国广告标准部门是管理广告、接受投诉的权威机构，该部门也能够就哪些内容可以在广告上出现提供咨询。大部分限制广告内容的现有法律条文只应用于报纸、杂志和电视广

告，但因特网上的广告也开始受到审查，所以在网上做广告时最好遵守同样的法律条文。通过学习本节，使学生了解毒蛇的种类。掌握毒蛇咬伤的分析与判断、急救处理及治疗措施。第一课时流血不止的处理（4）教师归纳三、乘汽车的安全自由能分布∆G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双

链结构内部碱基对的相对稳定性（结合的强弱程度）。一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9（绝对值，一般考虑末端5个碱基的ΔG。此值的大小对扩增有较大的影响，负值大，则3’末端稳定性高，

扩增效率更高，同时也更易于异位引发。因此在复杂模板的扩增体系中，3’末端5聚体的ΔG应大于-9.0kcal/mol），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。引物的3’端的∆G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反

应。（能值越高越容易结合）3′末端双链的ΔG是0～－2kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在－6时只有40%、到－8时少于20%、而－10时接近于0。引发效率（引物唯一性）选用的引物序列就应当是唯一的，即在模板中没有重复序列好的设计工具会提供一

个引物异位引发的评价指标，如Oligo6.0的falseprimingefficiency，即异位引发效率，这个值是由程序根据引物自身二级结构的能量、错配的类型、错配离3'末端的距离等因素综合计算而得出，

当此值大于200时便很有可能引发扩增。如所用工具无量化指标，则可依据经验，当引物与模板在非预期位置退火，超过70%的碱基能互补配对，或引物3’末端连续8个或以上碱基配对，则认为有引发的可能。2、引物设计软件Oligo6（

引物评价）*PrimerPremier（自动搜索）*VectorNTISuit（综合分析）PrimerExpress(实时定量PCR引物和探针设计)OmigaDnastarPrimer3（在线服务）*3、同源序列比较NCBI的BLAST;ExPASy的Alignment

GeneDoc3.2ClustalXVectorNTIOmiga，Bioxm，LaserGene，pcgene等引物同源性分析用Blast软件进行同源性比较•尽可能选择与非目的基因同源性小的序列作为引物•选择3’端与非目的基因不同源的序列作为引物•选择两个引物3

’端与同一非目的基因不同源的序列作为引物参数设置•默认引物长度-默认值为25•引物对搜索最大值-默认值为100•核酸浓度-默认值为250pM•单价离子浓度-默认值为50mM•游离Mg2+离子浓度-默认值为1.5mM•评分参数•Ratingparameter

s评分参数窗口是用来设定二级结构在引物评分中的权重系数二级结构越稳定引物评分就会越低相对于在引物中间形成的二级结构来说3末端的二级结构对PCR扩增的影响会更大为了将这一效应计算在内软件将3末端的二级结构的自由能数值G减去1这一修正会使3末

端的二级结构显得更加稳定Primerpremier5.0使用介绍参数设置载入序列PreimerPremier启动界面Loadsequence粘贴序列窗口这一窗口使得一段核酸序列通过选择以四种不同的方式

粘贴上去（CTRL-V）基本信息SequencenameOriginalsequenceUsethesetwobuttontotranslatetheDNAseqtoaproteinseqoraproteinse

qtoaDANseq8种密码子偏好Chooseafunction引物设计界面FirstyoucandesigntheprimermanuallySensestrandoranti-sensestrandUsefulinformationoftheprimer（3）如供应商在谈

判截止期后撤回谈判1.微机房是学校重点要害部位，管理人员应高度重视安全工作，相关人员安全保卫责任落实。（2）如果供应商在缴纳谈判保证金后撤回谈判。7．保持食堂内外的环境卫生，要经常对餐具用具进行清洗消毒，生熟案板刀具要分开存放。1.浸取的定义和分类2.溶

液的特性：3.在检查过程中，超声检查医生可以在超声诊断仪器里输入患者姓名，将图片先保存在机器中，报告医生负责手写报告，字迹要工整、清晰。7.体育课或课外锻炼中，凡出现受伤情况，应及时送往校医务室或医院，并及时向校长室汇

报。一、实行逐级防火责任制，做到层层有专人负责。6.施工车辆进入校区不准鸣号，应减速慢行，注意行人，沙、石、土不得散落校园，影响校园环境卫生。1.浸润阶段：药材与溶媒混合，溶媒混合附着于药材表面使之润湿，然后通过毛细管和细

胞间隙进入细胞组织内部。2．学生身边不准超规定存放现金，多余的钱一定要加密码存入银行，存折要妥善保管。（7）准备最需要的食品和水。1．知道在课间活动中要按顺序、守规则。2、认识游泳时可能发生的问题以及学会及时处理。如果客户提出售后服务方面的问题，销售人员不应替售后服务人员去回答

这些问题。因为每一个部门、每一个专业都有各自的分工。销售人员不可能承担售后服务的职能，而售后服务部门的人员比较清楚有关售后服务方面的问题，所以凡是遇到客户咨询售后服务方面的问题，最好把问题转给售后服务部门，

他们的回答比较专业，特别是一些技术上的问题。对这样的客户我们要注意的是，因为他是在做比较，所以他可能会在一个星期以上、一个月以内做出买车的决定。这是一种概率，不是绝对的，所以我们把一个星期以上和一个月之内可以做买车决定的客户称之为第三个等级。心理状态

这位客户是河南人，他说：“我想听豫剧。”目标：通过教学让学生正确认识地震这种自然现象，并了解地震有什么前兆。另外，也要注意应聘者讲话的语气、音调，这会影响别人对他们的看法。有时应聘者讲话的声音对他们的面试成功与否有很大影响。如果你招聘的

岗位是经理职位，或需要与新闻媒体沟通，一定要记住声音尖的人讲话不容易引人注意，也很难赢得别人好感。不过有的应聘者声音尖是由紧张引起的，应区别对待。引物搜索选项设定引物类型搜索模式5’引物位置范围3’引物位置范围

产物大小范围引物长度