【文档说明】PCR引物设计及相关软件数据裤的使用课件.ppt，共(91)页，1.927 MB，由小橙橙上传

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以下为本文档部分文字说明：

分子生物学实验课1、欢迎大家参加分生实验的学习；2、学习分生实验的重要性；3、课堂上守纪律，听老师安排，做实验穿白衣；4、每组做一份实验5、上课时间：上午8:00,下午13:00.6、每天实验结束应主动整理实验台，值日安排。实验仪器的使用及注意事项

加样器离心机一、加样器1、用途2、如何使用？根据取样量，选择合适的加样器。顶部标有加样器的最大量程，分别为：20ul:0.5~20l100/200ul:20~100/200l1000ul:200ul~1000l5ul

、50ul、500ul，应选择哪个加样器?练习：加样器读数为100，实际体积各为多少?(1)首先观察目前读数,假设为050:1000l:500l100/200l:50l20l：5l(2)顺时针调节

---读数变小逆时针调节---读数变大(3)加样器读数处于最大量程或最小量程时，如果向错误方向调节，超出量程，将会损害加样器的精度。如何调节加样器。1）选择加样器观察读数；调节读数；2）安装吸头（紧密）

；3）吸取液体按加样器第一挡；将吸头插入液面下适当深度；松开拇指（缓慢）,吸取液体4）打出液体抬起加样器；估计体积是否正确；移入容器；按到加样器第二档；打出液体（匀速）加样器使用步骤(示教及学生练习)：

加样器使用注意事项：1）吸头的安装（紧密）不要用手直接拿吸头，安上吸头后一定要再固定一下2）吸取液体枪头不能插入过深或过浅，过深可能会腐蚀加样器,过浅可能会吸入空气。吸取完液体后，估计体积的准确性（加样器可能会不准）吸头内有液体时，不能将加样器倒置或平放，以防液体倒

流损坏加样器！3）打出液体观察吸头内液体是否完全打出1、打开电源2、离心管中的液体为2/3,盖紧盖子,防止离心机被腐蚀。1代表转速盘上方的数据2代表下方的数据。3、样品配平,对称放入离心机(管的连接处朝外).二、离心机4、设定时间(旋转时间转扭，然后自己记

时间）。5、统一离心，逐渐升到要求转速。六个小组统一用一个离心机一起离心实验课的整体安排基因克隆3天.RNA提取逆转录及PCR重组质粒5天.重组质粒提取及酶切TA连接,T载体转化，平板筛选2天，基因组DNA提取及酶切后电泳离1天.序列查找及引

物的设计4天PCR引物设计及相关软件数据库的使用本次实验课课件不允许拷贝介绍如何查找基因的序列介绍NCBI的数据库，及检索页面介绍如何设计PCR引物，及设计引物的注意事项•扩增目的基因的全长•扩增目的基因的任意一部分讲解的内容（上午）介绍常规的生物学软件的使用Primer5.0;Ol

igo6.0;Blast;PCRDESIGN；讲解的内容（上午）(一）如何查找基因的序列观看录像GenBank数据库GenBank---序列数据库GenBank---是NIH遗传序列数据库，一个所有可以公开获得的DNA序列的注释过的收集网址：http://ww

w.ncbi.nlm.nih.gov/1.打开http://www.ncbi.nlm.nih.gov/网络演示1.根据文献如果你在文献种看到你感兴趣的基因，而且文中还提到在Genbank中的ID号直接打开

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/，在search后下拉框只中选择Nucleotide，把GnebankID号（AJ318831.1)输入GO前面的文本框中，点Go就可以找到了。例如：在2012年发表Biotechlo

gyletters文章(TheFMDVserotypebovineOFMDVusedtochallengesucklingmicewasstrainO/CHA/2/99(GenBankNO.AJ318831.1).http://www

.ncbi.nlm.nih.gov，在Search后的下拉框中选择Nucleotide，把GenbankID号输入GO前面的文本框中，点“GO”，就可以找到他了注意：同学们应该学会看Genbank数据库中基因的ID号打开http://www.ncbi.nlm.nih.gov

/在search后面的下拉框中选择Gene，然后在中间的文本框中输入基因名称“IFN-gamma”，点击GO...2.从Gene数据库中直接查找序列检索42项，哪一条是呢？（这也许是大多数人对Genbank的第一印象，东西太多，不知道是哪一个。）利用limits—高级检索Li

mits的意思其实就是高级检索，你可以在这里对检索词进行很多限制，这样能大大精简查询结果。这样就能获得我们所想要寻找的基因信息。提醒：注意一下右侧的基因相关信息，很有用的。可以看到Genomicregions,transcripts,andproducts，这

里显示了该基因在基因组中的位置，以及转录本的生成情况：若你只想获得序列（例如设计PCR引物，可以选择FASTA格式。FASTA格式的序列文件，没有其他数字和格式的干扰。在获得FASTA格式的序列后，需要关注一下Genebank中CDS的信息，来确认该基

因的编码序列。红色框中的才是IFN-gamma的编码序列IFN-cDNA的编码序列atgaaatatacaagttatatcttggcttttcagctctgcatcgttttgggttctcttggctgttactgccaggacccatatgtaaaagaagcagaaaacctt

aagaaatattttaatgcaggtcattcagatgtagcggataatggaactcttttcttaggcattttgaagaattggaaagaggagagtgacagaaaaataatgcagagccaattgtc

tccttttacttcaaactttttaaaaactttaaagatgaccagagcatccaaaagagtgtggagaccatcaaggaagacatgaatgtcaagtttttcaatagcaacaaaaagaaacg

agatgacttcgaaaagctgactaattattcggtaactgacttgaatgtccaacgcaaagcaatacatgaactcatccaagtgatggctgaactgtcgccagcagctaaaacag

ggaagcgaaaaaggagtcagatgctgtttcaaggtcgaagagcatcccagtaa3.从Nucletide数据库中直接查找序列打开http://www.ncbi.nlm.nih.gov

/在search后面的下拉框中选择Nucletide，然后在中间的文本框中输入基因名称“IFN-gamma”，点击GO...与gene数据库进入，查找的序列是一样的。2.从Gene数据库种查找基因序

列的优势：可以查看基因在基因组中的位置可以查看基因转录本的生成情况，因为有的基因有多种mRNA根据具体的课题需要选择mRNA剪接体，并选择其对应的编码序列Gene数据库与Nucleotide数据库查找基因序列的区别1.从Nucleotide数据库种查找基因序列的优

势：直接查看基因的mRNA序列，查找方式比较简单，快速TNF-alpha有七个mRNA剪接体。(二）如何设计PCR引物观看录像什么是引物？引物设计的原则是什么？介绍常用的引物设计的软件。引物同源性分析介绍内容引物是人工合成的两段

寡核苷酸序列。什么是引物？•PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合。•PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸。PCR反应成功扩增的一个关键条件在于引物的正确设

计。PCR反应需要两种引物，分别为5’引物和3’引物，或称为正向引物和反向引物。引物设计的原则3’5’5’3’5’5’targetsequence一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补。另一个引物与感兴趣区域另

一端的另一条DNA模板链互补。Genebank上显示的只有一条链的信息，一般情况下显示的是正链（编码链）。靠近正链5’端称为5’引物，靠近正链3’端称为3’引物正链负链首先回顾PCR原理：两条引物与模板结合的位置。5’引物3’引物atgaaatatacaagtgaagagcatcccagtaa3

’5’3’5’atgaaatatacaagt上游(5’)引物的结合CTTCTCGTAGGGTCATT下游(3’)引物的结合(1)5’引物照抄，3’引物互补倒读：Genebank上显示的只有一条链的信息，一般情况下显示的是正链（编码链）(4)引物方向：5→3(2)长度：特异性序列一般15-18

bp.常18-27bp，应≤38bp。(3)碱基分布：嘌呤，嘧啶随机分布；避免出现堆积现象。GC比值为45-55%。3’端和5’端引物具有相似的Tm值。Tm=4(G+C)+2(A+T)。(5)引物的3端：

严格与模板DNA配对。尤其是引物3′末端连续8个碱基要与模板严格互补。否则影响DNA聚合酶的延伸引物3′端要避开密码子的第3位引物5端修饰包括：加酶切位点；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；加入其它短序列包括起始密码子，终止密码子。标记生物素、荧光、地高辛

等；(6)引物的5端：引物的5’-端设计限制性酶切位点后PCR示意图第一次循环第二次循环第三次循环(7)引物内部不应存在互补序列。以避免折叠成发夹结构(Hairpin)不能有连续5个碱基的互补。引物末端一般不达到3bp。5´-GTTGACTTGATA3´-GA

ACTCTT(8)引物间不应存在互补序列.尤其应避免3’端的互补，以免形成引物二聚体3´-TGCTTAAGCACCGATGGCCA-5´5´-ACCGGTAGCCACGAATTCGT-3´(9)比较引物与基因组的同源性引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。与模板之间的特异性结合序列一般

不少于15-18bp。引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。利用Blast来分析引物与基因组的同源性稍后在讲已知IFN-cDNA序列,你该如何设计引物？atgaaa

tatacaagttatatcttggcttttcagctctgcatcgttttgggttctcttggctgttactgccaggacccatatgtaaaagaagcagaaaaccttaagaaatattttaatgcaggtcattca

gatgtagcggataatggaactcttttcttaggcattttgaagaattggaaagaggagagtgacagaaaaataatgcagagccaattgtctccttttacttcaaactttttaaaaactttaaagatgacc

agagcatccaaaagagtgtggagaccatcaaggaagacatgaatgtcaagtttttcaatagcaacaaaaagaaacgagatgacttcgaaaagctgactaattattcggtaactgacttgaatgtcca

acgcaaagcaatacatgaactcatccaagtgatggctgaactgtcgccagcagctaaaacagggaagcgaaaaaggagtcagatgctgtttcaaggtcgaagagcatcccagtaa举一个实例：1.设计PCR引物---扩增目的基因的全长2

.设计PCR引物---扩增目的基因的部分扩增目的基因的全长1.一般情况下，5’引物需位于编码基因的起始密码子的位置，3’引物位于编码基因终止子的位置。2.引物的5’端需加入多克隆酶切位点，方便后续的基因克隆

操作。3.注意：保证基因的阅读框架的不能改变。5’ATGAAATATACAAGTTATATCT…………………….TCGAAGAGCATCCCAGTAA3’3’TACTTTATATGTTCAATATAGA………………………..AGCTTCTCGTAGGGTCATT5’第一步：扩增IFN-基本序

列变性,引物复性atgaaatatacaagtgaagagcatcccagtaaatgaaatatacaagt3’5’3’5’上游(5’)引物的结合CTTCTCGTAGGGTCATT下游(3’)引物的结合IFN-序列5’引物：5’--ATGAAATATACAAGT－3’

3’引物：3’--TTACTGGGATGCTCTTC－3’特异性序列是否少了点?startcodonstopcodon5’引物照抄3’引物互补倒读第二步：GC比值；Tm值5’引物：5’--ATGAAATATACAAGT－3’3’引物：3’--TTACTGGGATG

CTCTTC－3’GC比值太少GC比值太多5’引物：5’－GCAGCGGATCCATGAAATATACAAGT－3’GC=11AT=153’引物:5’－ATCGGAATTCTTACTGGGATGCTCTTC－3’BamHIGC=12AT=15EcoRI----加酶切位点或G,C第三步：检测引物

的发夹结构，二聚体等。1.肉眼观察。2.利用软件检测，稍后在软件使用中讲解。经过上述三个步骤后，即将获得扩增IFN-gamma全长的引物：5’引物：5’－GCAGCGGATCCATGAAATATACAAGT－3’3’引物:5’－ATCGGAATTCTTACTG

GGATGCTCTTC－3’然后可以将序列信息送到生物公司进行合成。一对引物约30元人民币扩增目的基因的部分序列3.根据PCR产物的长度，选择5’引物和3’引物的在编码基因中的位置：常规PCR反应中：PCR产物的长度300bp左右；实

时定量PCR反应中，PCR产物的长度约150bp左右。1.引物的位置最好在cDNA保守区的位置进行设计。2.一般情况下，在设计RT-PCR引物时，5’引物和3’引物的距离之间跨越1-2个内含子。Extron1intron1Extron25’3’DNA序列的保守区是通过物种间相似序列

的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件比对，各基因相同的序列就是该基因的保守区。Homosapienshighmobilitygroupbox1(HMGB1),mRNANCBIReferenceSequence:NM_002128.4>gi|1189

18424|ref|NM_002128.4|Homosapienshighmobilitygroupbox1(HMGB1),mRNATGGAGAGTAATGTTACAGAGCGGAGAGAGTGAGGAGGCTGCG

TCTGGCTCCCGCTCTCACAGCCATTGCAGTACATTGAGCTCCATAGAGACAGCGCCGGGGCAAGTGAGAGCCGGACGGGCACTGGGCGACTCTGTGCCTCGCTGAGGAAAAATAACTAAACATGGG

CAAAGGAGATCCTAAGAAGCCGAGAGGCAAAATGTCATCATATGCATTTTTTGTGCAAACTTGTCGGGAGGAGCATAAGAAGAAGCACCCAGATGCTTCAGTCAACTTCTCAGAGTTTTCTAAGAAGTGCTCAGAGAGGTGGAAGAC

CATGTCTGCTAAAGAGAAAGGAAAATTTGAAGATATGGCAAAAGCGGACAAGGCCCGTTATGAAAGAGAAATGAAAACCTATATCCCTCCCAAAGGGGAGACAAAAAAGAAGTTCAAGGATCC

CAATGCACCCAAGAGGCCTCCTTCGGCCTTCTTCCTCTTCTGCTCTGAGTATCGCCCAAAAATCAAAGGAGAACATCCTGGCCTGTCCATTGGTGATGTTGCGAAGAAACTGGGAGAGATGTGGA

ATAACACTGCTGCAGATGACAAGCAGCCTTATGAAAAGAAGGCTGCGAAGCTGAAGGAAAAATACGAAAAGGATATTGCTGCATATCGAGCTAAAGGAAAGCCTGATGCAGCAAAAAAGGGAG

TTGTCAAGGCTGAAAAAAGCAAGAAAAAGAAGGAAGAGGAGGAAGATGAGGAAGATGAAGAGGATGAGGAGGAGGAGGAAGATGAAGAAGATGAAGATGAAGAAGAAGATGAT

GATGATGAATAAGTTGGTTCTAGCGCAGTTTTTTTTTTCTTGTCTATAAAGCA编码区：164-811黑色区域显示同源性较高的位置（bioEdit软件分析）第一步.引物的位置最好在cDNA保守区的位置进行设计。引物应该选择保守的位置，如1

50-370.如：470-580.高度变异，引物不能选择这个位置。当基因有多个mRNA剪接体时：第二步.引物的位置最好跨越基因的一个内含子。外显子的位置：（1-149,150-313,314-459,364-459,460-634…..)上游引物位置..150-313区间内下

游引物位置..314-370区间内上一步同源性比较的结果150-370的位置为保守区：可以选择：上游引物位置..163bp-183bp下游引物位置..307-327选择：第三步.根据PCR产物的长度，选择5’引物和3’引物的在编码基因中的位置：定量PCR反应中，PCR产物的

长度约150bp左右，第四步.根据引物设计软件对设计的引物进行检查（引物的GC比值，发夹结构，二聚体等）。GCATGGGCAAAGGAGATCCTAATTAGCAGACATGGTCTTCCAC引物设计软件•

PCRDESIGN（分析评价引物的功能，简单方便）•Oligo6.0（分析评价引物功能，最优秀）•PrimerPremier5.0（自助搜索引物的功能）-----生物软件网下载PCRDESIGN软件使用介绍-----检

测引物第一步。PCRDESIGN软件启动页面，输入A即可开始操作。第二步。编辑-粘贴-输入上游引物与下游引物的序列，按enter键。第三步。检测引物的是否有发夹结构（一般小于6个bp）第四步。检测上下游引物之间是否有互补序列，即引物的二聚体（一般小于6个bp）。第四步。检测上下游引物之间

是否有重复序列（一般小于6个bp）。第五步。检测上下游引物之间GC比值。Oligo6.44软件使用介绍Oligo6.44主要功能：用于引物的检测OpensequencefileOligo6.44启动界面点击：接受accept.弹出三个窗口

其中一个是：Meltingtemperature一般情况下在这个窗口上工作。编辑上游引物，输入上游引物在模板上结合的位置1.上游引物位置..163bp-183bp，与模板结合的位置为163-1的位置，输入162.2.

上游与模板结合后，序列是完全一致的。1.下游引物位置..307bp-327bp，与模板结合的位置为307的位置.2.下游引物与模板结合后，序列是完全一致的。引物分析HairpinDimerandcrossDimerGC%Tota

lPCRinformation1.检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。2.发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好3.检查为GC含量，以45-55％为宜4.检测与PCR其他模板上错配的位置。1.引物二聚体分析2.引物发夹结构分

析3.引物GC比值分析4.引物在模板上错配概率下游引物分析结果PrimerPremier5.0使用介绍PrimerPremier5.0使用介绍主要功能：用于引物的检索PreimerPremier启动界面LoadsequenceChooseafunction第一步.输入基因的序列第二步.搜索上下游

引物在基因序列中适合的位置。第三步.引物搜索选项设定引物类型搜索模式5’引物位置范围3’引物位置范围产物大小范围引物长度13个引物引物分值100分为满分每对引物的信息双击选中一对引物第四步，选择引物搜索的结果第五步.检测软件设计的引物是否出现引物自身发夹结构，二聚体，错配位点等上游引物搜索结果下

游引物搜索结果第六步，获取引物信息引物及产物信息一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有…引物设计软件小结•PCRDESIGN（分析评价引物的功能，简单方便）•Oligo6.0（分析评价引物功能，最优秀）•Primer

Premier5.0（自助搜索引物的功能）Oligo6.0与PrimerPremier5.0搭配使用，可快速设计出成功率高的引物。引物特异性检测设计PCR引物后，需要对引物的特异性进行检测。检测引物是否能与基因组或cDNA数据库中其他位置结合，扩增出非特异性条带。—Primer

BlastPrimer-BLAST可以直接从Blast主页进入：（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）PrimerBlast也可以直接用下面的链接进入：http://www.ncbi.nlm.nih.go

v/tools/primer-blast/提交的界面主要包括三个部分：targettemplate（模板区）,theprimers（引物区）,和specificitycheck（特异性验证区）1.在“PCRTemplate”下面的文本

框，输入目标模板的序列，FASTA格式或直接用AccessionNumber。输入验证引物根据需要设置外显子与内含子选项在specificitycheck区：4种数据库：RefSeqmRNA,Genome(selectedreferenc

eassemblies),Genome,andnr；多个物种（人，鼠）。Primer-blast软件检测结果检测结果显示：HMGB2基因虽然有相似区，但是3’端没有完全互补，因此该引物只能特异性地扩增HMGB1基因，不能扩增出HMGB2基因。Primer-blas

t软件检测结果下午序列查找及引物的设计教师指导下，学生自主读取基因的序列，设计引物（13：30-15：00）•根据不同的实验目的设计引物，比如全长，部分•总结自己所遇到的问题及解决方法，与他人分享ThemRNAsequenceofHomos

apiensinterferon,alpha1isasfollowed:1agaacctagagcccaaggttcagagtcacccatctcagcaagcccagaagtatctgcaat61atct

acgatggcctcgccctttgctttactgatggtcctggtggtgctcagctgcaagtc121aagctgctctctgggctgtgatctccctgagacccacagcctggataacaggaggacctt181gatgctcctggcacaaatgagcagaat

ctctccttcctcctgtctgatggacagacatga241ctttggatttccccaggaggagtttgatggcaaccagttccagaaggctccagccatctc301tgtcctccatgagctg

atccagcagatcttcaacctctttaccacaaaagattcatctgc361tgcttgggatgaggacctcctagacaaattctgcaccgaactctaccagcagctgaatga421cttggaagcctgtgtgatg

caggaggagagggtgggagaaactcccctgatgaatgcgga481ctccatcttggctgtgaagaaatacttccgaagaatcactctctatctgacagagaagaa541atacagcccttgtgcctgggaggttgt

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aattatttttgttcatataacgtcatgtgcacctttacactgt841ggttagtgtaataaaacatgttccttatatttactc测试题1.请设计一对引物，扩增IFN-alpha1的部分序列，用于IFN-alpha1基

因的检测。Group1ThemRNAsequenceofHomosapiensinterleukin4isasfollowed:1ttctatgcaaagcaaaaagccagcagcagccccaagctgataagattaatctaaag

agca61aattatggtgtaatttcctatgctgaaactttgtagttaattttttaaaaaggtttcatt121ttcctattggtctgatttcacaggaacattttacctgtttgtgaggcattttttctcctg181gaagagaggtgctgatt

ggccccaagtgactgacaatctggtgtaacgaaaatttccaat241gtaaactcattttccctcggtttcagcaattttaaatctatatatagagatatctttgtc301agcattgcatcgttagctt

ctcctgataaactaattgcctcacattgtcactgcaaatcg361acacctattaatgggtctcacctcccaactgcttccccctctgttcttcctgctagcatg421tgccggcaactt

tgtccacggacacaagtgcgatatcaccttacaggagatcatcaaaac481tttgaacagcctcacagagcagaagaacacaactgagaaggaaaccttctgcagggctgc541gactg

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ctggggcctggcgggcttgaattcctgtcctgtgaaggaagccaaccagagtacgtt721ggaaaacttcttggaaaggctaaagacgatcatgagagagaaatattcaaagtgttcgag781ctgaatattttaattt

atgagtttttgatagctttattttttaagtatttatatatttat841aactcatcataaaataaagtatatatagaatctGroup2测试题2.请设计一对引物，扩增IL-4的部分序列，用于IL-4基因的检测。测试题3.请设计一对引物，扩增IFN-alpha5的

部分序列，用于IFN-alpha5基因的检测。ThemRNAsequenceofHomosapiensinterferon,alpha5isasfollowed:1gcccaaggttcagggtcactcaatctcaacagcccagaagcatctgcaacctccccaatg61gc

cttgccctttgttttactgatggccctggtggtgctcaactgcaagtcaatctgttct121ctgggctgtgatctgcctcagacccacagcctgagtaacaggaggactttgatgataatg181gcacaaatgggaagaatctctcct

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cagaccttcaatctcttcagcacaaaggactcatctgctacttgggat361gagacacttctagacaaattctacactgaactttaccagcagctgaatgacctggaagcc421t

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41tgtgcatgggaggttgtcagagcagaaatcatgagatccttctctttatcagcaaacttg601caagaaagattaaggaggaaggaatgaaaactggttcaacatc

gaaatgattctcattga661ctagtacaccatttcacacttcttgagttctgccgtttcaGroup3测试题4.请设计一对引物，扩增IFN-alpha6的全长，需要表达IFN-alpha6蛋白质。ThemRNAsequenceofHomosapi

ensinterferon,alpha6isasfollowed:1atggctttgccttttgctttactgatggccctggtggtgctcagctgcaagtcaagctgc61tctctggactgtgat

ctgcctcagacccacagcctgggtcacaggaggaccatgatgctc121ctggcacaaatgaggagaatctctcttttctcctgtctgaaggacagacatgacttcaga1

81tttccccaggaggagtttgatggcaaccagttccagaaggctgaagccatctctgtcctc241catgaggtgattcagcagaccttcaacctcttcagcacaaaggactcatctgttgcttgg301gatgagaggc

ttctagacaaactctatactgaactttaccagcagctgaatgacctggaa361gcctgtgtgatgcaggaggtgtgggtgggagggactcccctgatgaatgaggactccatc421ctggctgtgagaaaatacttccaaa

gaatcactctctacctgacagagaaaaagtacagc481ccttgtgcctgggaggttgtcagagcagaaatcatgagatccttctcttcatcaagaaac541ttgcaagaaaggt

taaggaggaaggaataaGroup4引物两端需要加入酶切位点EcoRⅠ和HindⅢ.EcoRIGAATTCHindⅢAAGCTTThat’sallfortodayThankyou