【文档说明】生物制药-第三章-基因工程制药-基因工程药物制造实例和质量控制课件.ppt，共(38)页，771.142 KB，由小橙橙上传

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第八节基因工程药物制造实例一、干扰素二、人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子三、人白细胞介素-2四、美洲商陆抗病毒蛋白干扰素（interferon，IFN）是人体细胞分泌的一种活性蛋白质，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节活性，是人体防御系统的重要组成部分。根据分子结构和抗原性的差异分为α、β、γ、ω等

4个类型。α型干扰素在分为ɑ1b，ɑ2a，ɑ2b等亚型，其区别表现在个别氨基酸的差异上。一、基因工程菌的组建构建干扰素工程菌流程图一、干扰素基因工程菌的组建流程诱生的白细胞提取全RNA通过寡dT-纤维

素柱蔗糖密度梯度获得寡A的mRNA离心提取12s的mRNA逆转录成cDNA双链cDNA接上dT或dG尾pBR322质粒pBR322质粒加上dA或dC退火获的杂交质粒转化大肠杆菌扩增杂交质粒筛选抗青霉素但对氨苄青霉素敏感细菌克隆用杂交翻译法挑选含干

扰素cDNA克隆将干扰素cDNA克隆入表达载体在大肠杆菌中进行高效表达二、基因工程干扰素的制备启开种子制备种子液发酵培养粗提精提半成品制备半成品检定分装冻干成品检定成品包装制备基因工程干扰素ɑ的工艺流程图三、人ɑ2b型干扰素(hIFN—

ɑ2b)工程菌株的组建过程•应用PCR的方法，从人的染色体片段制备人ɑ2b干扰素的cDNA，将其克隆到pRC23表达载体上，构建成重组表达质粒pMZI2B，并转化大肠杆菌DH5a，组建成工程菌株。由于p

MZI2B的ɑ2b基因5’端起始密码ATG上游编制了一段SD顺序，与PL启动子上连接的SD顺序组成双SD顺序，所以克隆基因的表达水平有明显的提高。1.hIFN-ɑ2b基因的获得•用于克隆的人ɑ2b干扰素基

因是应用PCR方法从带有人ɑ2b干扰素基因的染色体片段获得的：模板DNA4ng，引物为50pmol/L，各25µL4×dNTP4µL，TaqDNA聚合酶2.5µL，10×PCR反应缓冲液10µL，补水使总反应体积为100µL。反应条件：变性温度为94℃，退火温度为50℃，链延伸温度为72℃。共30

个循环。•采用PCR技术扩增的人ɑ2b干扰素基因片段，经1%琼脂糖凝胶电泳分离，其片段大小约相当于0.55kb。将该片段插入质粒pGEM-3的EcoRI和BamHI的位点上，转化大肠杆菌DH5a，培养后提取质粒DNA，用引物SP6和T7从两端测定DNA顺序。

结果证明其顺序与文献报道的基因顺序是一致的。2．重组表达质粒pMZI2B的构建•pGEM-3／ɑ2bB质粒经EcoRI和BamHI双酶解，切下ɑ2b-B片段，纯化后克隆到质粒pRC23的EcoRI和Ba

mHI位点上，构建成重组表达质粒pMZI2B(见图)。3．人ɑ2b型干扰素工程菌株的形成与基因的表达•将重组表达质粒pMZI2B转化大肠杆菌DH5a形成工程菌。经37℃摇床培养后进行抗病毒活性检测。•结果表明，具有双

SD序列的pMZI2B的抗病毒活性(1.69x104IU／mL)，与仅具有单SD序列的pMZI2A(其组建过程同上)的抗病毒活性(3.46xl03IU／mL)相比，有显著的提高。这是因为基因的表达水平与转录和翻译两个主要环节密切相关，而SD序列在蛋白质翻译中是核糖体的识别和结合部位，

因此，增加SD序列，即增加了蛋白质翻译时核糖体的识别和结合机率。α2b干扰素的生产4.发酵工程菌：SW-IFNα-2b/E.coliDH5α，质粒用PL启动子，含氨苄青霉素抗性基因。培养基含1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%NaCl。

摇床培养30℃，10h，培养发酵罐种子。15L发酵罐培养，30℃，8h。然后42℃，2-3h即可完成发酵。每隔2h取样测OD或离心去上清称量菌体湿重。4.产品的提取与纯化4,000r/min离心30分钟，去上清，得湿菌泥。湿菌超声破碎，离心，取沉淀部分，溶液处

理，离心取上清液，上清超滤浓缩，SephadexG50分离。经SDS-PAGE检查。再经DE-52柱纯化人干扰素ɑ2b。质量控制标准和要求⒈半成品检定⑴干扰素效价测定⑵蛋白质含量测定⑶比活性⑷纯度测定⑸相对分子量测定⑹残余外源性DNA含量测定

⑺残余血清IgG含量测定⑻残余抗生素活性测定⑼紫外光谱扫描⑽肽图测定⑾等电点测定⑿除菌半成品应做干扰素效价测定、无菌试验、热原质试验。⒉成品检定⑴物理性状⑵鉴别试验⑶水分测定⑷无菌试验⑸热原试验⑹干扰素效价测定⑺安全试验美洲商陆第九节基因工程药物的质量控制•基因工程药物与传

统意义上的一般药品的生产不同，首先它是利用活的细胞作为表达系统，所获蛋白质产品往往相对分子质量较大，并具有复杂的结构；许多基因工程药物还是参与人体一些生理功能精密调节所必需的蛋白质，极微量就可产生显著效应(每剂量的用量：白介素-12仅0.1µg，ɑ干扰素也只有10~30µg)，任何药物性

质或剂量上的偏差，都可能贻误病情甚至造成严重危害。•基因工程药物需要在宿主细胞中表达的外源基因，在转录或翻译、精制、工艺放大过程中，都有可能发生变化，所以从原料—制备过程—产品的每一步都必须严格控制条件和鉴定质量，确保产品符合质量标准、安全有效。一、原材料的质量控制•原材料

的质量控制是要确保编码药品的DNA序列的正确性，重组微生物来自单一克隆，所用质粒纯而稳定，以保证产品质量的安全性和一致性。•应该了解：①需要明确目的基因的来源、克隆经过、限制性内切酶酶切图谱、核苷酸序列

；②应提供表达载体的名称、结构、遗传特性及其各组成部分(如复制子、启动子)的来源与功能，构建中所用位点的酶切图谱，抗生素抗性标志物；③应提供宿主细胞的名称、来源、传代历史、检定结果及其生物学特性等；④需阐明载体引人宿主细胞的方法及载体在宿主细

胞内的状态，如是否整合到染色体内及在其中的拷贝数、宿主细胞与载体结合后的遗传稳定性；⑤提供插入基因与表达载体两侧端控制区内的核苷酸序列，在生产过程中，启动与控制克隆基因在宿主细胞中表达的方法及水平等。二、培养过程

的质量控制•在工程菌菌种贮存中，要求种子克隆纯而稳定；在培养过程中，要求工程菌所含的质粒稳定，始终无突变；在重复生产发酵中，工程菌表达稳定；始终能排除外源微生物污染。三、纯化工艺过程的质量控制•产品要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯物分子

批间保持一致性；外源蛋白质、DNA与热原质都控制在规定限度以下。•在精制过程中避免宿主细胞蛋白质、核酸、糖类、病毒、培养基成分等的污染，并用相应的方法进行检测。四、目标产品的质量控制•需要综合利用生物化学、免疫学、微生

物学、细胞生物学和分子生物学等多门学科的理论与技术所建立起来的鉴定方法，以保证基因工程药品安全有效。1、产品的鉴定①肽图分析②氨基酸成分分析③部分氨基酸序列分析④重组蛋白质的浓度和相对分子质量测定⑤蛋白质二硫键分析重组蛋白质药物产品

常用的鉴定方法2．纯度分析纯度分析是基因工程药物质量控制的关键项目，它包括目的蛋白质含量测定和杂质限量分析两个方面的内容。(1)目的蛋白质含量测定测定蛋白质含量的方法可根据目的蛋白质的理化性质和生物学特性来设计。通常采用的方法有还原性及非还原性

SDS-PAGE、等电点聚焦、各种HPLC、毛细管电泳(CE)等。•(2)杂质基因工程产物的杂质包括蛋白质和非蛋白质两类。•通常需要检测的杂质及其检测方法见下表。基因工程产物中常见杂质和污染物及其检测方法3．生物活性测定•生物活性测定是保证基因工程药物产品有效性的重要手段，往往需要进行动物体内试

验和通过细胞培养进行体外效价测定。4．稳定性检验•药品的稳定性是评价药品有效性和安全性的重要指标之一，也是确定药品贮藏条件和使用期限的主要依据。•采用恰当的物理化学、生物化学和免疫化学技术对其活性成分的性

质进行全面鉴定，要准确检测在贮藏过程中由于脱氨、氧化、磺酰化、聚合或降解等造成的分子变化。5．产品一致性的保证•以重组DNA技术为主的生物制药是一个十分复杂的过程，生产周期可达一个月甚至更长，影响因素较多。需要对原料—生产—产品的每一环节都进行严格的控制和质量检定，才能确保各批最终产

品都是安全有效、含量和杂质限度一致并符合标准。五、产品的保存1、液态保存（1）、低温保存（2）、稳定pH条件下保存（3）、高浓度保存（4）、加保护剂保存•蛋白质的稳定剂有糖类、脂肪类、蛋白质类、多元醇、有机溶剂等；有些蛋白质在高离子强度的极性环境下才能保持其活性，加入中性盐可稳定

这些蛋白质；某些蛋白质表面或内部含有半胱氨酸巯基，容易被空气中的氧缓慢氧化为次磺酸或二硫化物，使蛋白质的电荷或构象发生改变而失活，可加入β-巯基乙醇、二硫苏糖醇等，在真空或惰性气体中密闭保存。2、固态保存•固态蛋白质比液态稳定，一般蛋白质含水量降到5

％时，在室温或冰箱中保存均比较稳定，但在37℃保存时活性则明显下降。•长期保存蛋白质的最好方法是把它们制成干粉或结晶。冻干粉或结晶都具有强抗热性和稳定性，在干燥器中，4℃以下可保存相当长的时间。第三章基因工程制药思考题（4）1、设计一个实验方案

用基因工程的方法生产人干扰素α2b。2、常用的基因工程药品的保存方法有哪些？Havearest!