【文档说明】重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因课件.ppt，共(28)页，1.521 MB，由小橙橙上传

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重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因课件摘要：在重编程过程中，转录组分析可以显示出一些分子变化，但是对给定的因子在重编程过程细胞命运发生转变的各个阶段其功能并不清楚。本研究通过全基因组RNAi筛查和转录组分析鉴定出了重编程过程细胞命运发生转变各时段的的关键基因和所需要的细胞事件。与信号通

路有关的基因（如ltpr1,ltpr2,pdia3等）在细胞获得多能性前构成细胞主要的调控网络。ips细胞在成熟过程中一些关键基因集的激活（如Utf1，Tdgf1等）起到重要作用。全基因组RNAi筛查结果显示

，绝大多数（53%-70%）RNAi的靶基因表达量在重编程过程中不发生变化。在这些表达量不发生变化的的基因中Dmbx1,Hnf4g,Nobox,Asb4对重编程起重要作用。而Nfe2，Cdkn2aip，Msx3，Dbx1，Lzts1，Gtf2i，Ankrd22对重编程起到阻碍作用

。总之，作者的结论对重编程细胞命运转变各阶段所需要的基因功能提供了大量信息。背景介绍：背景介绍：OSKM+shRNA0d（pMX-DsRed）3-5dThy1：earlystagemarker7dSSEA1：midtolatestage

markerDsRed+DSRed-Thy1+/SSEA1-InitialstageThy1-/SSEA1+TransitionstageSSEA1+/DsRed+PredeterminedstageSSEA1

+/DsRed-Maturereprogrammedstage14d结论：1.对重编程细胞全基因组RNAi筛查的实验策略：-3d分选出慢病毒侵染后表达DsRed细胞80%1%-2.5%1.对重编程细胞全基因组RNAi筛查的实验策略：14d分选出处于重编程4个阶段的细胞。结论：1.对重

编程细胞全基因组RNAi筛查的实验策略：“differentiallyexpressed”Embryonicdevelopment,cellcycle,celldeath基因表达上调Cellularfunctionandmaintenance,moleculartr

ansport,metabolism“Non-differentiallyexpressed”(ESCfunction)(basalcellularfunctions)结论：2.鉴定细胞重编程各阶段转录标志转录组结果表明在重编程早期阶段

转录组就发生了大规模的重构“细胞命运识别阶段”“细胞命运决定阶段”对重编程因子的环境“压力”相应破坏体细胞转录本网络ESC特定调控网络的建成结论：2.鉴定细胞重编程各阶段转录标志结论：2.鉴定细胞重编程各阶段转录标志Earlystepinreprogramming：ly

z,lyzs(destructionofsomaticregulatorynetworks)“Earlyreprogramming”:Nanog,Sall4,Esrrb,Dppa4,Dppa5a,Dnmt3b,Dnmt3l(ESCcorecircui

try)“maturereprogrammed”:Utf1,Tdgf1,Gsc,Fgf10,T,Chrd,Dppa3,Fgf17,Eomes,Foxa2(reinforcetheregulatorypathwaysinESCcorecircuit

ry)结论：3.发现了更多适合用于诱导重编程和分化的组织来源SSEA1+/DsRed-cells其转录本接近于由视觉系统，生殖脊以及免疫系统诱导分化的细胞。而早期的SSEA-细胞转录本不与任何细胞系或组织器官相似，提示其细胞具有复杂异质性。并且上述转录本相似

的组织细胞可以提示用来重编程。结论：4.在细胞命运决定前的”初期”阶段，细胞信号通路起决定作用。作者推断，在分选出四个不同时期的重编程细胞群体中，可能通过全基因组RNAi筛选出在细胞命运转变所必须的基因，于是作者提取四个细胞群体的DN

A进行高通量测序，对shRNA文库的靶基因序列进行聚类分析。细胞群体最少（~0.2%-0.4%）但却拥有最多的富集的shRNA的靶基因序列。提示其全基因组功能分析确实可能找到了一些重编程过程必不可少的功能基因。结论：信号通路相关的shRNA靶基因突然增多，作者将其解释重编程的“初期”阶段需要感受

更多信号来决定下步细胞命运4.在细胞命运决定前的”初期”阶段，细胞信号通路起决定作用。可能突破重编程效率的一些因子：Egf，Flt1，ll1rl1,Ly96细胞骨架发生变化结论：4.在细胞命运决定前的”盛年”阶段，细胞信号通路起决定作用。这些基因中许多基因的调控网络的中心节点就

是Nanog等核心调控网络5.表达不发生变化的基因也在细胞命运转换过程中起重要作用Seeds（键）query是否可以将对两组数据深度分析-1shRNA靶基因的特殊的转录本找出？5.表达不发生变化的基因也在细胞命运转换过程中起重要作用重编程各阶段特

殊的功能基因转录本并不能找到一个特定表达模式。提示这些必要的功能基因可能并不在mRNA水平发生变化。否5.表达不发生变化的基因也在细胞命运转换过程中起重要作用Seeds（键）query是否可以将对两组数据深度分析-2是否可以通

过差异表达的转录本找到细胞命运发生转变所需的行驶特殊功能基因？5.表达不发生变化的基因也在细胞命运转换过程中起重要作用2.RNA表达量有差异，但通过RNAi筛查不能聚类的基因1.RNA表达量有差异，并且通过RNAi筛查能聚类的基因3.RNA表达无差异

，但RNAi筛查能富集的基因！（依然可能在重编程过程中行驶重要功能）4.RNA表达无差异，并且RNAi筛查不能聚类的基因6.高效率鉴定重编程过程中正向调控因子和障碍6.高效率鉴定重编程过程中正向调控因子和障碍Positiveregulator6.高效率鉴定重编程过程中

正向调控因子和障碍6.高效率鉴定重编程过程中正向调控因子和障碍6.高效率鉴定重编程过程中正向调控因子和障碍Barriergene6.高效率鉴定重编程过程中正向调控因子和障碍再次验证一些表达量不发生变化的基因在重编程过程中也起非常重要作用重编程各过程各阶段值得深入研究因子重编程各过程各阶段值得

深入研究因子•总结：•可借鉴之处：•1.运用多种marker将重编程细胞各个时段有效分开•2.运用新的全基因组RNAi筛查技术找到一些通过转录组分析不能找到的重编程过程行驶功能的基因。•3.通过RNAi和转录组分析可以高效找出重编程过

程的正向负向调控因子，并且重要的是一些重编程过程必须的因子表达量可能不发生变化。•4.解释了重编程各个人为划定时段的一些细胞生理装态。•5.RNAi大规模筛选比传统knockdown效率提高很多，并且对重编程在组学水平上提供了功能性的解释，而非传统描述性的组学，可

能提供更多有效信息。•个人需要改进之处：•全基因组RNAi筛查作为新技术，商品化的shRNAs文库设计能否更有效的特异性knockdown靶基因，而不影响其他基因的表达量，能否针对某种细胞开发更合适的shRNAs文库，并且反转录病毒导入OSKM以及shRNAs难免会引起一些

基因的表达模式发生变化，shRNAs的最适合用量等技术层面的改进可以在日后更加完善。