【文档说明】应生张寿丽实验二光合色素的提取理化性质分离吸收光谱及含量的测定.doc，共(8)页，23.335 MB，由精品优选上传

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专业：应用生物科学班级：13应生姓名：张寿丽学号：134120258实验二、光合色素的提取、理化性质、分离、吸收光谱及含量的测定一、实验目的：1、掌握光合色素的提取方法以及了解有关的理化性质。2、掌握光合色素的分离方法

以及了解有关的吸收光谱。3、掌握用分光光度计测定叶绿素含量的方法。二、实验原理：1、光合色素能溶于具有一定极性的有机溶剂，如丙酮、乙醇等。2、提取液中无任何电子受体，因此可以观察荧光现象。3、离体叶绿素在有氧气和光照条件下，发生光氧化作用，结构遭到破坏，形成加

氧叶绿素等产物。4、叶绿素是一种双羧酸酯，可以发生皂化反应。5、叶绿素分子中Mg2+与仆啉环结合不稳定，可以被H+、Cu2+、Zn2+等离子所取代。6、不同光合色素的分子量、分子结构、极性、溶解度、支持物对它们的吸附

力等不同，因而分配系数不同，故彼此可以分开。7、叶绿素的卟啉环结构对光有很强的吸收，主要是红光和蓝紫光。8、混合液中的两个或多各组分，只要它们的光谱吸收峰不互相重叠，仍然可以根据Lambert-Beer定律（A=kLC）求出各组分含量。Lambert定律：A=

kL；Beer定律A=kC。叶绿素a、b在80%丙酮溶液中的Amax分别为663nm、645nm，由此得出：见推导过程Ca=12.7A663–2.69A645；Cb=22.9A645–4.68A663Ca+b=8.02A663+20

.20A6459、A663=Ca.ka1+Cb.kb1A645=Cb.kb2+Ca.ka2分光光度计测出，故求二元一次方程组可得到此公式。10、k——比吸收系数。即溶剂和波长不变的情况下，当物质的浓度(C)为1g/L(0.1

%)，比色皿的直径(光径，L)为1cm时所测出的吸光度即为比吸收系数。11、ε——摩尔吸收系数。即溶剂和波长不变的情况下，当物质的浓度(C)为1mol/L，比色皿的直径(光径，L)为1cm时所测出的吸光度即为摩尔吸收系数。三、实验药品及仪器：（一）

、材料：叶子花的叶片。（二）、药品：碳酸钙、石英砂、丙酮、30%KOH甲醇溶液、苯、50%醋酸、醋酸铜、80%丙酮、石油醚。（三）、仪器：解剖剪、滤纸、漏斗、吸量管、试管，三角瓶、洗耳球、离心管、研钵、酒精灯、分光光度计、便携式叶绿

素测定仪、离心机、试管夹、试管架。四、方法及步骤：（一）、光合色素的提取：将植物叶片洗净并用滤纸洗干，取1/2片叶片，放入研钵中并加入少许CaCO3和石英砂及5ml丙酮，充分研磨，再加入10ml丙酮，研磨，静止片刻，上清液过滤于三角瓶中，待用。1、荧光现象：与

光线垂直的方向观察色素颜色。2、光破坏作用：1ml色素提取液于室内，1ml于太阳光下，30min后观察颜色变化。3、皂化反应：取一支试管，加入色素提取液2.5ml，再加入30%KOH甲醇溶液1ml，摇匀，再加入苯2.5m

l，轻轻摇动，沿试管壁慢慢加入自来水1ml，轻轻摇动后观察，注意观察整个过程颜色的变化。4、取代反应：取一支试管，加入3ml色素，逐滴加入50%醋酸直至溶液变为黄褐色。倒出一半，加入少许醋酸铜粉末，酒精灯上加热，与

另一半比较颜色的差异。（二）、光合色素的分离和吸收光谱：1、光合色素的提取：将植物叶片洗净并用滤纸洗干，取1/3片叶片，放入研钵中并加入少许CaCO3和石英砂及5ml丙酮，充分研磨，再加入10ml丙酮，研磨，静止片刻，上清液过滤于

三角瓶中，待用。2、光合色素分离：剪取适当长度和宽度的滤纸条→用上行纸层析法分离色素→启动剂：石油醚：丙酮：苯=10：2：1。3、吸收光谱的测定：（1）、光合色素的吸收光谱：取色素溶液1mL，加入丙酮3mL，摇匀后在分光光度计上400到700nm处每隔10nm进行

扫描。（2）、各色素的吸收光谱：上述层析出的3~4种色素，分别剪下后溶于3mL丙酮中，按上述方法扫描。（三）、光合色素含量的测定：1、快速测定法：由于叶绿素a、b在652nm处有共同吸收，k=34.5Lg-1.cm-1。可直接用便携式叶绿素测定仪测定植物叶片的叶绿素含量，

最后浓度单位为mg/dm22、分光光度计法：色素提取：将上述植物叶片洗净并用滤纸吸干，准确称取已知Φ的叶圆片0.05g，加入少许CaCO3和石英砂及80%丙酮2ml，充分研磨，转入离心管中（离心机使用），再用5ml80%丙酮洗研钵

，转入离心管中，平衡，5000rpm离心10min,记录上清液体积，取1ml稀释到4ml。测定：以1cm比色皿分别测定A663、A645。使A控制在0.1~0.8之间。五、结果及分析：（一）、光合色素的

提取及其理化性质：1、荧光现象：色素提取液在透射光下呈绿色，在反射光下呈红色。分析：当叶绿素分子吸收收光子以后就由最稳定、最低能量的基态上升到一个不稳定的、高能状态的激发态，激发态及其不稳定，停留时间一般不超过几纳秒就迅速

向较低能状态转变，转变的途径有将光能转变为热能、光能及经激发态的叶绿素将光能传递给附近的其它分子等三个途径，荧光现象即由转变为光能的途径中转变为荧光的途径引起，仅占三条去路中的0.5%。2、光破坏现象：色素提取液在

阳光照射30min后由绿色变为褐色。分析：离体叶绿素在有氧气和光照条件下，发生光氧化作用，结构遭到破坏，形成加氧叶绿素等产物，该产物呈褐色，故叶绿素提取液变为了褐色。3、皂化反应：在色素提取液中加入30%KOH甲醇后溶液由绿色变为灰绿色；再加入苯以后分为上黄绿，中浅绿，下深绿三层；加入水震荡后变为

上层黄绿下层深绿两层。分析：叶绿素分子是一种羧酸脂，能发生皂化反应。4、取代反应：加入硫酸铜粉末并在酒精灯上加热的溶液由黄色变为绿色。分析：叶绿素分子中Mg2+与仆啉环结合不稳定，可以被H+、Cu2+、Zn2+等离子所取代。加入醋酸后H+取代了Mg2+形成黄褐色的去镁叶绿素，加入硫酸铜粉末后

H+又被Cu2+取代，形成蓝绿色的铜代叶绿素。（二）、光合色素的分离和吸收光谱：1、光合色素的分离：滤纸条上自上而下出现黄橙色、黄色、蓝绿色、黄绿色四个色带，蓝绿色和黄绿色两个色带更加清晰。分析：不同光合色素的分子量、分子结构、极性、溶解度、支持物对它们的吸附力

等不同，因而分配系数不同，故彼此可以分开。3、吸收光谱的测定：（1）、未层析的光合色素的吸收光谱如图所示：400~500nm为蓝光区，650~700nm为红光区，图上在这两个区域出现了吸收峰，故它们主要吸收的光为红光和蓝光。（2）、叶绿素a的吸收光谱如图所示：图中在400nm处显示有两个吸收峰

，在700nm附近的光区有一个吸收峰，在400nm光区附近的第一个吸收峰是叶黄素的吸收峰，应该是叶绿素a提取液受到了叶黄素的污染，其余两个吸收峰则是叶绿素a吸收峰。（3）、叶绿素b的吸收光谱如图所示：

图中在450nm附近显示有两个吸收峰，在700nm处有一个吸收峰,在450nm前方的吸收峰是叶黄素的吸收峰，其余两个吸收峰则是叶绿素b的吸收峰，叶绿素b提取液受到了叶黄素的污染。（4）、叶黄素的吸收光谱如

图所示：图中450nm附近有两个吸收峰。（5）、胡萝卜素的吸收光谱如图所示：图中在450nm光区附近有一个吸收峰。（三）、光合色素含量的测定：1、用便携式叶绿素测定仪测定出该叶片叶绿素的含量53.1mg/dm2。2、用分

光光度计测得：离心后上清液的体积为4.7ml，叶片质量为0.05g。A663=0.479AA645=0.199ACa=12.7A663–2.69A645=5.54799A叶绿素a在叶片中的含量为：Ca*4*4.7/(0.0

5*1000)mg/g=2.086mg/gFWCb=22.9A645–4.68A663=2.31538A叶绿素b在叶片中的含量为：Cb*4*4.7/(0.05x1000)mg/g=0.871mg/gFWCa+b=8.02A663+20.20A645=7.86138A叶绿素a、

b在叶片中的含量为：Ca+b*4*4.7/(0.05*1000)mg/g=2.956mg/gFW结论：叶子花叶片中叶绿素a的含量为2.086mg/gFW，叶绿素b的含量为0.871mg/gFW，叶绿素a+叶绿素b的含量为2.956mg/gFW。六、思考与讨

论：1、为什么在皂化反应中只能用20%KOH甲醇溶液，而不能用20%KOH水溶液？答：皂化反应是酯水解反应的一种。酯水解反应本身就有速率慢，反应不彻底的缺点，而光合色素的水溶性又很差，用氢氧化钾的水溶液势必会浪费很多原料。而用甲醇，能使反

应物充分接触，有利于增加反应速率和提高原料利用率。2、光合色素的吸收光谱对我们理解光合作用有何意义？答：它是叶绿体吸收光能进行光合作用的证据，可以解释清楚光合作用吸收和不吸收的光区，助于我们队光合作用具体机制的理解。3、试论述高等

植物光合色素的种类和生理功能。答：叶绿素a：能收集和传递光能，少数处于激发状态的叶绿素a可以将光能转化为电能进行光合作用。叶绿素b:收集和传递光能。叶黄素和胡萝卜素：收集和传递光能，防止叶绿素的光氧化。4、两种测定方法含量有何不同？为

什么？答：快速测定法用便携式叶绿素测定仪测定植物叶片的叶绿素含量，局部含量测定。比较准确，但不便于整体测定，取样多次平均值也不能代表整体叶绿素含量；分光光度计法采用低杂散光,高分辨率的单光束单色器,保证了波长准确度.波长重

复性和更高的分辨率,自动调0%T和100%T,自动调波长用多种方法的数据处理功能,高分辨,宽大的样品糟,可容纳100mm,光径吸收池和相应的反射附件,仪器配有标准的RS-232双向通讯接口,可外接打印机,打印相应的实验数据.个性代的外形设计,轻触式按键使操作更为方便.可见分光光度计广泛应

用于医药,卫生,化工,学校,生物化学,石油化工,质量控制,环境保护及科研实验室等化学分析。5、怎样把方法一中的叶绿素含量mg/dm2转换为方法二中的mg/gFW？怎样测定不同形态的植物叶片的叶面积？答：设该叶片中叶绿素的质量为

m1，算出含有m1叶绿素所需叶片的体积，取出与该体积相同大小的叶片，称重，称出叶片的质量m2，m1/m2即可。方法一：选取单位面积重量是一个常数的打印纸如A4或16K。一般A4打印纸为70~105GSM（g/m2）。用铅笔轻轻地沿着叶缘在A4纸上划线。用剪刀沿着叶缘剪下A4纸。称

所剪下的A4纸的重量W(g)，叶的面积=W/GMS。方法二：阿基米德定律。