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医学基因工程和其医学应用基因重组：不同的DNA分子间发生共价连接形成重组DNA分子。重组DNA质粒DNA基因片段2医学基因工程和其医学应用重组DNA技术发展史3医学基因工程和其医学应用pSC101EcoRIBoyer和Cohen的实验Boyer和Cohen的实验pR6-5大肠杆菌4医学基

因工程和其医学应用pSC101pR6-5抗四环素抗卡那霉素EcoRI抗卡那霉素基因DNA连接酶重组DNA分子5医学基因工程和其医学应用培养平皿四环素平板卡那霉素基因四环素\卡那霉素基因大肠杆菌6医学基因工程和其医学应用7医学基因

工程和其医学应用克隆来自同一始祖的相同拷贝的集合。（一）DNA克隆分子克隆细胞克隆动物克隆8医学基因工程和其医学应用DNA克隆应用酶学方法，在体外将某些遗传物质的DNA与载体DNA结合，形成一种具有自我复制能力的DNA分子，转化至宿主细胞中，进行

扩增、提取获得大量同一DNA分子。9医学基因工程和其医学应用DNA克隆目的基因载体复制子宿主细胞扩增扩增提取DNA分子10医学基因工程和其医学应用生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等目的①分离获得某一感兴趣的

基因或DNA②获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程(geneticengineering)——实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。（二）基因工程11医学基因工程和其医学应用SS基因基因载体重组体分切接转筛表SS12医学基因工程和其医学应用按照人的

愿望设计和建造非天然的基因表达体系。某功能蛋白宿主细胞重组体目的基因13医学基因工程和其医学应用第二节自然界的基因重组DNARecombination14医学基因工程和其医学应用一、接合作用当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的

DNA转移称为接合作用(conjugation)。15医学基因工程和其医学应用可接合质粒如F因子(Ffactor)质粒——细菌染色体外的小型环状双链DNA分子16医学基因工程和其医学应用二、转化作用通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞

或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用(transformation)。17医学基因工程和其医学应用例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。18医学基因工程和其医学应用19医学基因工程和其医学应用三、转导作用当病毒从被感染的（供体）细胞释

放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用(transduction)。20医学基因工程和其医学应用λ噬菌体的生活史溶菌生长途径(lysispathw

ay)溶源菌生长途径(lysogenicpathway)例目录21医学基因工程和其医学应用目录22医学基因工程和其医学应用发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称基

本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。（一）同源重组四、基因重组23医学基因工程和其医学应用（二）位点特异重组位点特异重组(site-s

pecificrecombination)是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。24医学基因工程和其医学应用例λ噬菌体DNA的整合λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特异地识别、整合

反转录病毒cDNA的长末端重复序列(longterminalrepeat,LTR)。25医学基因工程和其医学应用（三）转座重组由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座(transposition)。26医学基因工程和其医学应用第三节基因工程的核心技术27医学基因工程和其医学应用一

、重要的技术工具◼限制性核酸内切酶◼DNA聚合酶Ⅰ◼逆转录酶◼T4DNA连接酶◼碱性磷酸酶◼末端转移酶◼TaqDNA聚合酶28医学基因工程和其医学应用重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中

相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ①合成双链cDNA分子或片段连接②缺口平移制作高比活探针③DNA序列分析④填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I

大片段，具有完整DNA聚合酶I的5→3聚合、3→5外切活性，而无5→3外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶①合成cDNA②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进

行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基29医学基因工程和其医学应用限制性核酸内切酶定义限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链D

NA的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ30医学基因工程和其医学应用作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。分类Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）31医学基因工程和其医学应

用第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名HindⅢ属系株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d

株的第三种酶32医学基因工程和其医学应用Ⅱ类酶识别序列特点——回文结构(palindrome)切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG33医学基因工程和其医学应用BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCT

AGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口34医学基因工程和其医学应用同功异源酶来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+Bam

HⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ35医学基因工程和其医学应用同尾酶有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)

。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAGGATCTA36医学基因工程和其医学应用（二）基因载体定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒D

NA37医学基因工程和其医学应用克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。38医学基因工程和其医学应

用载体的选择标准◼能自主复制；◼具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；◼有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；◼分子量小，以容纳较大的外源DNA。39医学基因工程和其

医学应用1.质粒(plasmid)特点能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。40医学基因工程和其医学应用目录41医学基因工程和其医学应用42医学基因工程和其医学应用λ噬菌体DNA改造系统λgt系列（插入

型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）2.噬菌体(phage)M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列43医学基因工程和其医学应用3.粘性质粒(cosmid)44医学基因工程和其医学应用酵母人工染色

体(yeastartificialchromosome,YAC)细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其他45医学基因工程和其医学应用（一）核酸探针与分子杂

交二、常用技术的原理和用途核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分

子之间形成杂化双链(heteroduplex)。46医学基因工程和其医学应用复性RNADNA47医学基因工程和其医学应用探针技术探针(probe)一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，

判断是否有同源的核酸分子存在。48医学基因工程和其医学应用DNA印迹技术(Southernblotting)用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。RNA印迹技术(Northernblotting)用于RNA的定性定量分析。蛋白质的印迹分析(Westernblotting)用于蛋白质定性定

量及相互作用研究。49医学基因工程和其医学应用其他斑点印迹(dotblotting)原位杂交(insituhybridization)DNA点阵(DNAarray)DNA芯片技术(DNAchip)50医学基因工程和其医学应用三种印迹技术的比较51医学基因工程和其医学应用DNA点阵52医学基因工程和

其医学应用5Primer15Primer2Cycle2Cycle1555555TemplateDNA55555555（二）聚合酶链反应53医学基因工程和其医学应用Cycle35555555555555

55525～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。54医学基因工程和其医学应用◼模板DNA◼特异性引物◼耐热DNA聚合酶◼dNTPs◼Mg2+PCR体系基本组成成分55医学基因工程和其医学应用PCR的基本反应步骤

变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C56医学基因工程和其医学应用1目的基因的克隆2基因的体外突变3DNA和RNA的微量分析4DNA序列测定5基因突变分析PCR的主要用途57医学基因工程和其医学应用三

、重组DNA技术基本原理基本原理目的基因的获取DNA导入受体菌外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达58医学基因工程和其医学应用以质粒为载体的DNA克隆过程59医学基因工程和其医学应用（一）目的基因的获取

1.化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库(cDNAlibrary)4.聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)（见第22章）60医学基因工程和其医

学应用*化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列61医学基因工程和其医学应用组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合*从基因组DNA文库获取目的基因62医学

基因工程和其医学应用mRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子cDNA文库反转录酶载体受体菌复制*从cDNA文库获取目的基因逆转录酶AAAATTTTAAAASI核酸酶DNA聚合酶Ⅰ碱水解TTTT63医学基因工程和其医学

应用（三）外源基因与载体的连接1.粘性末端连接方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接（二）克隆载体的选择和构建64医学基因工程和其医学应用BamHⅠ切割反应GGATCCCCTAGGT4DNA连接酶15ºCGATCCGG

CCTAG+目的基因用BamHⅠ切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG载体DNA用BamHⅠ切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGA

TCCGGATCCGGATCCGGATCCG重组体GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接65医学基因工程和其医学应用2.平端连接适

用于：限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端66医学基因工程和其医学应用目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连67医学基因工程和其医学应用3.同聚物加尾连接在末端转移酶(te

rminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。68医学基因工程和其医学应用5´3´3´5´载体DNA5´3´3´5´目的基因限制酶或机械剪切限制酶5´3´3´5´5´3´T(T)nT

T(T)nT3´5´5´3´3´5´5´3´A(A)nAA(A)nA3´5´λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT4DNA连接酶15ºC重组体69医学基因工程和其医学应用4.人工接头(linker)连接由平端

加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。70医学基因工程和其医学应用人工接头及其应用CCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ71医学基因工程和其医学应用受体菌条件安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态(co

mpetent)导入方式转化(transformation)转染(transfection)感染(infection)（四）重组DNA导入受体菌72医学基因工程和其医学应用（五）重组体的筛选1.直接选择法(1)抗

药性标记选择(2)标志补救(markerrescue)(3)分子杂交法原位杂交Southern印迹2.免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等73医学基因工程和其医学应用原位杂交75医学基因工程和其医学应用Southern印迹目录76医学基因工程和其医学应用重组DNA技术操作过程可形象归纳为小

结分分离目的基因切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体转转入受体菌筛筛选重组体77医学基因工程和其医学应用重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNAcDNA人工合成PCR产物

限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交78医学基因工程和其医学应用表达体系的建立表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离纯化（六）克隆基因的表达79医学基因工程和其医学应用1.原核表达体系（E.coli

表达体系最为常用）标准：选择标志强启动子翻译调控序列多接头克隆位点E.coli表达体系的不足不宜表达真核基因组DNA不能加工表达的真核蛋白质表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusionbody)很难表达大量可溶性蛋白80医学基因

工程和其医学应用优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累缺点：操作技术难、费时、经济转染——将表达载体导入真核细胞的过程方法：磷酸钙转染DEAE葡聚糖介导转染电

穿孔脂质体转染显微注射2.真核表达体系酵母、昆虫、乳类动物细胞81医学基因工程和其医学应用第四节基因工程在医学中的应用82医学基因工程和其医学应用（一）疾病基因的发现与克隆根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。（二）生物制药

83医学基因工程和其医学应用重组DNA医药产品产品功能组织胞浆素原激活剂抗凝血液因子VIII促进凝血颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成促红细胞生成素剌激白细胞生成生长因子(bFGF,EGF)刺激细胞生

长与分化生长素治疗侏儒症胰岛素治疗糖尿病干扰素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶抗组织损伤单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗乙肝疫苗(CHO,酵母)预防乙肝口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱84医

学基因工程和其医学应用基因诊断(geneticdiagnosis)是利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。（三）基因诊断基本过程区分或鉴

定DNA的异常分离、扩增待测的DNA片断85医学基因工程和其医学应用标准.能正确扩增靶基因；.能准确区分单个碱基的差别；.本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定;.便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查。86医学基因工程和其医学应用（四）基因治疗定义基因治疗(geneth

erapy)是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。方式体细胞基因治疗(somaticcellgenetherapy)性细胞基因治疗(germlinegenetherapy)87医学基因工程和其医学应用1.产前诊断2.携带

者测试3.症候前诊断4.遗传病易感性（五）遗传疾病的预防88医学基因工程和其医学应用