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医学分子生物学MedicalMolecularBiology1第一章绪论Introduction2第一节分子生物学和医学分子生物学研究的研究范围一、分子生物学的主要内容1.核酸的分子生物学2.蛋白质的

分子生物学3.信号转导的分子生物学3二、医学分子生物学的主要内容（一）人体发育、分化和衰老的分子生物学基础（二）细胞增殖的分子基础（三）人体三大功能调控系统（神经、内分泌和免疫）的分子生物学基础（四）基因的结

构异常或表达异常与疾病的关系（五）应用分子生物学技术进行基因诊断、基因治疗、生物制药和卫生防疫。4第二节分子生物学的发展史一、分子生物学的形成二、分子生物学的发展第三节分子生物学在医学中的应用一、人体发育调控和人体功能调控的分子生物学基础二、基因与疾病三、生物工程与生物制

药四、预防医学5第三章基因组的结构与功能StructureandFunctionofGenome6基因（gene)：是核酸分子中贮存遗传信息的遗传单位，是贮存蛋白质多肽链或RNA序列信息及表达这些信息所必需的全部

核苷酸序列。7基因组（genome）：细胞或生物体中，一套完整单倍体的遗传物质的总和称为基因组。8结构基因（structuralgene）：是指能转录生成RNA或编码多肽链的DNA序列。假基因（pseudogene）：是指与功能正常的基因序列相似，但无转录功能

，或转录产物无功能的基因。9断裂基因（splitgene）：又称为不连续基因，即由内含子（非编码序列）和外显子（编码序列）组成的基因。多数真核生物基因为断裂基因。10非剪接基因（non-splicinggene）：又称为连续基因，即无内含子序列的基因，转录产物无须剪接，

可直接用来翻译合成蛋白质。原核生物基因和少数真核生物基因为非剪接基因。11重叠基因（overlappinggene）：相邻两个或几个基因之间在序列上有重叠现象，这种基因称为重叠基因。基因家族（genefamily）：功能相关的基

因构成各种基因家族。12第一节病毒基因组VirusGenome13病毒（Virus）的组成病毒virus核衣壳nucleocapsid包膜（来自宿主细胞膜）envelope核酸Nucleicacid衣壳capsidDNARNA

（由蛋白质排列构成）14病毒（Virus）的结构球状病毒的衣壳多具有二十面对称结构15病毒衣壳二十面对称结构16Schematicdiagramofhumanimmunodefiencyvirus（HIV）包膜蛋白包膜核酸衣壳核衣壳17杆状病毒衣壳

为螺旋对称结构RNAProteinsubunit18烟草mosaic病毒19一、病毒基因组核酸的主要类型双链DNA单股正链DNA双链RNA单股负链RNA单股正链RNA201、双链DNA环状DNA线状DNA21这类病毒基因组DNA复制的类型：（1）通过DNA复制

过程完成基因组复制。大多数DNA病毒基因组属这种类型。2223（2）先转录生成RNA中间体，然后再通过逆转录过程完成基因组的复制。如乙肝病毒（hepatitisBvirus,HBV）。24核酸分子的正链与负

链：序列与mRNA相同的核酸链，称为正链；与mRNA互补的核酸链，称为负链。25GAATCGTTACCGCGCATAGTTGGCCTTAGCAATGGCGCGTATCAACCGGAAUCGUUACCGCGCAUAGUUGGCmRNADNA负链正链CUUAGCAAUGGCGCGUAUCAACC

G负链RNA26HBV-DNA的复制机制正链负链线状双链DNA带有部分单链区的环状双链DNA共价闭环双链DNA闭环27以负链为模板进行转录翻译合成核衣壳蛋白逆转录前基因组RNA核衣壳RNA酶H28也可整合入宿主细胞染色体中292、单链正股D

NA这类病毒包括自主微小病毒、依赖微小病毒、M13噬菌体。30解链复制复制正股DNA负股DNA双股DNA正股DNA复制31翻译病毒蛋白质转录RNA包装成病毒颗粒负链正链可降解负股DNA正股DNA32特点：①进入宿主细胞后复制形成双链，并通过D

NA复制过程完成基因组的复制；②其基因转录方式类似于真核细胞，即以负链为模板转录生成mRNA。333、双链RNA动物呼肠孤病毒和各种噬真菌体属于这类病毒。CUUAGCAAUGGCGCGUAUCAACCGGAAUCGUUACCGCGCAUAGUUGGC特

点：①通过RNA复制过程完成基因组的复制；②以负链RNA为模板转录生成mRNA344、单链负股RNA特点：①进入宿主细胞后复制形成双链RNA，并通过RNA复制过程完成基因组的复制；②复制形成的正链RNA无5`帽和3`polyA结构，不能作为合成蛋白质的模板；③以负链RNA为模板转录生成

带有5`帽和3`polyA的mRNA，可翻译生成病毒蛋白质。355、单链正股RNA这类病毒基因组的复制和转录机制有两种：（1）通过RNA复制过程完成基因组的复制；正股RNA既可以作为mRNA，翻译合成蛋白质，也可以包装形成病毒颗粒。（2）通过DNA中间体完成基因组复制。36转录逆转

录复制整合翻译合成病毒蛋白质包装形成病毒颗粒病毒RNAcDNA双链DNA宿主DNA前病毒37二、病毒基因组结构与功能的特点1、不同病毒基因组大小相差较大病毒基因组大小（kb）RNA病毒小RNA病毒科7.2~8.4披盖病毒科12黄病毒科10DNA病毒乙肝病毒3.2痘病

毒300382、不同病毒基因组可以是不同结构的核酸病毒基因组的类型乳头瘤病毒闭环双链DNASV40病毒闭环双链DNA腺病毒线状双链DNA疱疹病毒线状双链DNA噬菌体M13单链环状DNA脊髓灰质炎病毒单链RNA呼肠孤病毒双链RNA393

、病毒基因组有连续的也有不连续的病毒基因组核酸分子连续性数目DNA病毒连续1冠状病毒连续1小噬菌体Q连续1流感病毒不连续8呼肠孤病毒不连续10404、病毒基因组的编码序列大于90%5、除逆转录病毒基因组有两个拷贝

外，其他病毒基因组都是单倍体。41HIV426、病毒基因有连续的和间断的间断基因连续基因内含子外显子43编码病毒的各种衣壳蛋白基因7、相关基因丛集转录转录后加工多顺反子mRNAmRNA448、基因重叠A基因B基因459、病毒基因组含有不规则结构基因（1）几个结构基因的

编码区无间隔；（2）mRNA没有5`端的帽子结构；（3）结构基因本身没有翻译起始序列。46三、典型病毒基因组介绍（一）SV40病毒（猴空泡病毒40）基因组晚期转录区早期转录区Ori47SV40病毒基因组早期基因转录区晚期基因转录区T抗原基因t抗原基

因VP1VP2VP3调控区复制起始点启动子增强子48（二）乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus,HBV）基因组HBV基因组是由正负两条链组成的带单链区的环状DNA分子，分子中的重要成分有：1、顺向

重复序列（DR）:DR1,DR22、S区段：S基因、前S1基因、前S2基因3、C区段：编码HBcAg4、P区段：编码逆转录酶（依赖RNA的DNA聚合酶）5、X区段：编码的X蛋白功能不详49DR2TP50（三）逆转录病毒基

因组5`-帽-R-U5-PB--DLS--gag-pol-env-(onc)-C-PB+-U3-R-poly(A)n-3`51HIV-1HIV-2progp1205`-polintgp41-3`LTRgagRNas

eHvptviftatvputatrevLTRnefpolprogp1205`-polintgp41-3`LTRgagRNaseHvpxvifvprtatrevLTRnefpolenvRREenv52第二节原核生物基因组ProkaryoteGenome5354一、原核生

物基因组结构与功能的特点1、基因组通常仅由一个环状双链DNA分子组成；55大肠杆菌染色体的类核结构环状DNA类核中央562、基因组中只有一个复制起始点；573、具有操纵子结构IPOZYAImRNAIPOZYA

阻遏蛋白ImRNARNA聚合酶-半乳糖苷酶乳糖透性酶半乳糖苷乙酰化酶多顺反子mRNA584、编码顺序一般不会重叠,只有少数基因存在重叠现象；5、基因是连续的，无内含子；因此，转录后不需要剪切；6、编码区在基因组中所占比例（约50%）远远大于真核生物基因组，但又远远小于病毒基因组；非编码区主要是

一些调控序列；597、基因组中重复序列很少；8、具有编码同工酶的基因；9、存在可移动序列，包括插入序列和转座子；10、具有多种功能的识别区域，如复制起始区、复制终止区、转录起始区、转录终止区等。60二、质粒（pl

asmid）（一）概念：质粒是细菌细胞内携带的染色体外的能独立进行复制的环状DNA分子。61（二）质粒的遗传控制1、复制调控系统：控制质粒的拷贝数。Orirep基因cop基因复制调控系统622、分配系统：使质粒在细菌细胞分裂过程中精确分配到子细胞中。质粒中发挥

这种作用的区域称为分配区。3、细胞分裂控制系统：抑制细胞分裂，使细胞分裂与质粒复制协调，避免太多不含质粒子细菌出现。634、位点特异重组系统：控制质粒在细菌细胞内的多聚体与单体相互转变过程。位点特异重组系统att位点Int酶Xis酶FIS

因子IHF因子质粒自身提供宿主提供645、质粒的不相容性：具有相同复制起始点和分配区的两种质粒不能共同存在于同一个细菌细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。65（三）质粒的类型1、接合型质粒、可移动型质粒和自传递质粒

2、严谨型质粒和松弛型质粒3、窄宿主谱质粒和广宿主谱质粒66三、转位因子（transposableelement）（一）概念：转位因子，即可移动的基因成分，是指能够在一个DNA分子内部或两个DNA分子之间移动的DNA片段。在细菌中，则指

可在质粒和染色体之间或在质粒和质粒之间移动的DNA片段。67（二）转位因子的类型及其特征转位因子插入序列转座子可转座的噬菌体681、插入序列（insertionsequence,IS）特征：（1）是一类较小的没有表型效应的

转座因子，长度约700~2000bp；（2）由一个转位酶基因和两侧的反向重复序列（invertedrepeatsequence,IR）组成；（3）可双向插入靶位点，在插入后的两侧可形成顺向重复序列（）69插入序列IRIR转位酶基因IR---GAATT

CGGCTTAAG------CTTAAGCCGAATTC------GAATTCGGAATTCG------CTTAAGCCTTAAGC---DR702、转座子（transposon,Tn）（1）特征：①是一类较大的可移动成

分；②含有关转座的基因，如转座酶；③带有一个或几个与转座作用无关的但可决定宿主菌遗传性状的基因，如大肠杆菌毒素Ⅰ基因、抗药性基因等。71（2）类型①复合型TnIR或类IR转座酶基因两侧臂结构基因序列72②TnA族转座酶（TnpA）阻遏和解离蛋白质（TnpR）-内酰胺酶

反向序列内解离区Tn3的结构73③接合型Tn一类可以在细菌间通过接合进行转移的Tn；无末端反向重复序列，转座后不产生顺向重复序列；转座方式类似-噬菌体整合的专一性重组。743、可转座的噬菌体（transposablephage）是一类具有转座功能的溶源性噬菌体。（三）转位作用的

机制75受体DNA供体DNA靶位点转座子7677第三节真核生物基因组EukaryoteGenome7879一、真核生物基因组结构与功能的特点1、每一种真核生物都有一定的染色体数目，除配子（精子和卵子）为单倍体外，体细胞一般为双倍体；如:果蝇8条（4对）小鼠40条（20对）人

46条（23对）802、真核生物基因组远远大于原核生物的基因组，结构复杂，基因数庞大，具有许多复制起始点，每个复制子大小不一；如：大肠杆菌DNA全长4.6106bp，含4000个基因。人类染色体单倍体DNA全长3×109bp，含

3~4万个基因。813、真核生物基因都由一个结构基因与相关的调控区组成，转录产物为单顺反子；内含子外显子启动子增强子5`-UTR3`-UTR增强子真核生物结构基因及其主要调控元件UTR:非编码区；增强子可以位于基因的上游

或下游较远处824、真核生物基因组中含有大量重复序列；5、真核生物基因内非编码序列占90%；6、真核生物基因大多数为断裂基因；7、功能相关的基因构成各种基因家族8、真核生物基因组中也存在可移动的遗传因素——转座子。83二、真

核生物基因组的结构结构基因顺式调控元件基因家族重复序列转座子端粒84（一）结构基因——断裂基因内含子外显子hnRNAmRNA（单顺反子）转录转录后加工85（二）顺式调控元件（cis-actingelements）启动子上游启动子元件增强子沉默子（负增强子

或抑制子）反应元件加尾信号861、启动子（promoter）（1）启动子是RNA聚合酶特异识别和结合的DNA序列，位于基因转录起始点的上游，具有启动基因转录的作用，但本身不被转录。（2）真核生物基因启动子原件——TATA盒。（3）上游

启动子元件——CAAT盒、CACA盒、GC盒等。872、增强子（enhancer）（1）DNA中某些序列与相应的反式作用因子结合后，可增强启动子的作用，提高基因的转录活性，这些序列被称为增强子。（2）增强子可位于结构基因的上游或下游，距离启动子

可远可近，其作用通常与方向和距离无关。88（3）没有增强子，启动子通常无活性；没有启动子，增强子也无法发挥作用。（4）通常可决定基因表达的时间特异性和组织细胞特异性。893、负增强子（negativeenhancer）或沉默子（silencer）DNA中某些序列与特

定的反式作用因子结合后，可抑制启动子的作用，降低基因转录活性，这些序列被称为负增强子。904、反应元件（responseelements）一些信息分子的受体被细胞外信息分子激活后，能与DNA的特异序列结合，调控基因的表达。这种特异的DNA序列被称为反应元件。如：热休

克反应元件（heatshockresponseelements）糖皮质激素反应元件（glucocorticoidresponse）915、加尾信号AAUAAA(GU或U)n加尾信号92（三）基因家族（genefamily）类型：1、核酸序列相同。如r

RNA基因家族、tRNA基因家族、组蛋白基因家族等。2、核酸序列高度同源。如人类生长素基因家族。3、编码产物具有同源功能区。如src癌基因家族。934、编码产物具有小段保守基序。如DEAD（Asp-Glu-Ala

-Asp）盒基因家族。5、基因超家族（genesuperfamily）。如免疫球蛋白基因超家族。94（四）重复序列1、高度重复序列：重复次数>105类型：卫星DNA反向重复序列2、中度重复序列：重复次数10~105如rRNA基因、tRNA基因、组蛋白基因、免疫球蛋白基因等。3、单拷贝序列：仅出现

一次或少数几次。95（五）转座子转录逆转录整合逆转录转座子96（六）端粒端粒区端粒下区着丝点端粒区端粒下区染色体97GGG(TTAGGG)nCCC(AATCCC)n人DNA端粒结构重复单位重复次数98GGGTTAAA

UCCCAAUGGGTTAGGGTTAAAUCCCAAUGGGTTAGGGTTAAAUCCCAAUGGGTTAGGGTTAGGGTTAAAUCCCAAU5`3`端粒酶作用机理99三、人类基因组的组织结构特征人类基因组具有上述真核基因组的基

本结构特点。此外，最为突出的特征是：基因组的DNA总量约3×109，其中编码序列占5%以下，非编码序列占95%以上。非编码序列中存在大量重复序列。人类基因组的DNA序列多态性100（一）人类基因组的重复序列反向重复序列串联重复序列散在重

复序列1011、反向重复序列（invertedrepeats）AGCTAGTACATGCATGCGTACTAGCTTCGATCATGTACGTACGCATGATCGA反向重复序列（中间无间隔的又称为回纹结构）102CAGTAGTACTAGCTTGCCATGATCGAAGCT

AGTACTCGATCATGTACGTGCA反向重复序列易形成链内碱基配对而呈“发夹”式或“+”字形结构1032、串联重复序列（tandemrepeats）重复序列的重复单位成串排列。（1）编码区串联

重复序列如组蛋白基因。ACAATT-ACAATT-ACAATT…ACAATT……104（2）非编码区串联重复序列①大卫星DNA②小卫星DNA③微卫星DNA1053、散在重复序列Interspersedrepeats（1）短散在重复序列（sho

rtinterspersednuclearelements,SINEs）。如Alu家族（灵长类特有）。（2）长散在重复序列（longinterspersednuclearelements,LINEs）。如KpnⅠ家族。106（一）人类基因组

的DNA多态性同种生物的不同个体之间基因组DNA序列的差异性，称为基因组DNA的多态性。1、位点多态性（DNAsitepolymorphism）位点多态性也称为基因多态性，即指在人群中的同一基因位点上有多个等位基因。1072、限制性片段长度多态性（r

estrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）由于DNA多态性可引起某种限制性内切酶酶切位点的消失或新位点出现，因此应用同一种限制性内切酶消化不同个体的DNA时，会得到长度各不相同的限制性酶切片段类型。这种现象称为限制

性片段长度多态性。108MstⅡAB1.3kp1.1kp0.2kpMarker1093、串联重复多态性（tandemrepeatpolymorphism）（1）小卫星DNA多态性（2）微卫星DNA多态性110第八章基因工程Geneticengin

eering111DNA重组：不同来源的DNA分子通过磷酸二酯键连接而形成重新组合的DNA分子的过程，称为DNA重组（DNArecombination）。112基因工程的概念：按照既定的目的和方案，把目的基因片段与载体D

NA连接形成重组DNA分子，然后将其导入宿主细胞，并对含有目的基因的细胞进行克隆，最后利用克隆的基因表达、制备蛋白质或多肽，或定向改造细胞乃至生物个体。这种技术方法称为基因工程。113基因工程的基本过程：目的基因的制备

载体的制备目的基因与载体的连接重组DNA分子导入宿主细胞含目的基因细胞的筛选和鉴定114第一节工具酶115工具酶限制性内切核酸酶DNA聚合酶Ⅰ（Klenow片段）逆转录酶T4DNA连接酶碱性磷酸酶末端脱氧核苷酰转移酶TaqDNA聚合酶和其它耐热DNA聚合酶修饰酶116一、限制性内

切核酸酶（一）概念限制性内切核酸酶（restrictionendonuclease）是指能识别双链DNA分子内部特异位点并在识别位点或附近水解磷酸二酯键的一类内切核酸酶，简称为限制酶（restrictionenzyme）。117（二）限制酶的分类Ⅰ限制酶：通常在识别位点下游100~100

0bp处切割DNA，切割位点难以预测。Ⅱ限制酶：在识别位点切割DNA，切割位点固定，序列可知。Ⅲ限制酶：在识别位点附近切割DNA，切割位点难以预测。118（三）限制酶的命名命名规则：用来源细菌的英文缩写斜体符号命名。它的第一个字母大写，代表细

菌的属名；第二、三字母小写，代表细菌的种名；第四个字母代表菌株；最后用罗马字母表示同一菌株中不同限制酶的编号。119名属种株序来源称名名名号菌株EcoRⅠEcoRⅠEscherichiacoliRHindⅢHindⅢHaemophilusinfluenzaedHindⅡHindⅡHaemoph

ilusinfluenzaedHpaⅠHpa/ⅠHaemophilusparainfluenzae120（三）限制酶的识别和切割位点特点：1、通常是由4~6个碱基对组成的具有回纹序列的DNA片段；5`---GAATTC---3`3`---CTTAAG---5`1212、大多数

限制酶是错位切割双链DNA，产生5`或3`粘性末端；5`---GAATTC---3`3`---CTTAAG---5`5`---GAATTC---3`3`---CTTAAG---5`EcoRⅠ5`粘性末端1225`---CTGCAG---3`3`---GACGT

C---5`5`---CTGCAG---3`3`---GACGTC---5`PstⅠ3`粘性末端1233、部分限制酶沿对称轴切割DNA双链，产生平端。5`---CCCGGG---3`3`---GGGCCC---5`5`---CCCGGG---3`3`---GG

GCCC---5`平端SmaⅠ124（四）同功异源酶来源不同但能识别和切割同一位点的限制酶。5`---GGATCC---3`3`---CCTAGG---5`BamHⅠ和PstⅠ的共同识别位点125（五）同尾酶有些限制酶识别序列不同，但可产生相同粘性末端，这些酶称为同尾酶。5`---

GGATCC---3`3`---CCTAGG---5`5`---GGATCC---3`3`---CCTAGG---5`BamHⅠ1265`---NGATCN---3`3`---NCTAGN---5`5`---NGATCN---3`3`

---NCTAGN---5`Sau3A127二、修饰酶（一）DNA聚合酶ⅠKlenow片段的用途：1、补齐双链DNA的3`末端；2、双链DNA3`末端的标记；3、在cDNA合成中，第二链的合成；4、DNA序列的分析。128（二）逆转录酶主要用于cDN

A的合成，构建cDNA文库。（三）T4DNA连接酶（四）碱性磷酸酶（五）末端脱氧核苷酰转移酶（六）TaqDNA聚合酶和其它耐热DNA聚合酶129第二节载体vector130载体（vector）载体克隆载体表达载体质粒噬菌体粘性质粒M13噬菌体大肠杆菌表载体酵母菌表达载体哺乳动物表达载体

131一、克隆载体（一）质粒（plasmid）132质粒（plasmid）概念：质粒是细菌细胞内携带的染色体外的能独立进行复制的环状DNA分子。133质粒的特性（1）寄生性（2）稳定性（3）自主复制性（4）传递性（5）表型效应（6）不相容性（7）

重组性（8）可消除性（9）分子量较小134组建理想载体的质粒应具备的特点：1、分子量较小。2、拷贝数较高。3、具有可供选择的遗传标记。4、具有多个限制酶的单一切点（多克隆位点）。5、具有复制起始点。135HindⅢEcoRⅠ

BamⅠHindⅠMstⅠ多克隆位点Multiplecloningsites136常用的克隆质粒载体:pBR322pUC系列pGEM系列pUC18pUC19137pBR3224363bpAprTcrori138AprLaclZ

`pUC18HindⅢEcoRⅠ139pUC192686bpEcoRISaclKpnlSmalXmalBamHlXbalHincllPstlSphlHindlllamprlacllacZ`ori0447A

mlll806Ppai1765Ctr10i11779Gsul1784Scal2177Xmnl2294Sspl2501Aatll26117EcoO1092674Ndel183Narl235Plac图15-7质粒pUC193961

40（二）噬菌体噬菌体（bacteriophage）141溶菌感染重组感染细菌噬菌溶菌性溶源性体142噬菌体衣壳蛋白基因整合和重组基因粘性末端粘性末端调控区143插入型载体置换型载体两类噬菌体载体适用于建立cDNA基因文库的噬菌体载体：

gt10gt11这两种载体属于插入型载体。144CI43.3kbgt10LacZ43.7kbgt11145（三）粘性质粒1、构成：由噬菌体的cos区和质粒构成。2、特点：（1）带有抗药性基因，如Ampr、Tctr（2

）带有cos区（3）具有一个或多个限制酶酶切位点。146（4）分子量较小，但能容纳较大的DNA片段。（5）粘性质粒较小，体外不能包装，但其重组体可体外包装。147（四）M13噬菌体单链DNA用于序列分析148二、表达载体（expressing

vector）表达载体是用来在受体细胞中表达外源基因的载体。表达载体常由克隆载体改造而来。常用表达载体的受体细胞：原核细胞——大肠杆菌、分支杆菌、放线菌等；真核细胞——酵母菌、哺乳动物细胞、人体细胞。149（一）大肠杆菌表达载体大肠杆菌表达载体应有的结构成分：复制起始点抗性基因多克隆位点表达系统元

件150表达系统元件：PRBS启动子核糖体结合位点MCSTS多克隆位点终止信号1511、启动子（promoter）大肠杆菌表达载体中常用的启动子：（1）trp-lac启动子（又称tac启动子）tac启动子是一种人工构建的双杂合启动子，由trp启动子、lac操

纵子的操纵基因和SD序列融合而成。受lac阻遏蛋白的抑制，异丙基硫代半乳糖苷的诱导表达。152（2）噬菌体PL启动子特点：受温度的控制，低温（37C）下被阻遏而抑制，高温（42C）下去阻遏而激活。（3）T7噬菌体启动子1532、核糖体结合位点（ribosome-binding

site,RBS）RBS由SD序列、核糖体识别序列和起始密码（ATG）组成。但有时也将SD序列称为核糖体结合位点。154ACACUAGGUCUCCUAGGAPuPuUUUUPuPuAUG3`5`核糖体小亚基的16SrRNA5`3`mRNASD序列核糖体小亚基

识别序列起始密码SD：Shine-Dalgarno，人名SD序列：…AGGA…或…AGGAGG…1553、转录终止序列一般由一段GC富集区组成的反向重复序列，具有回纹结构，转录产物的对应区可行成“发夹”结构。转录终止机制有两种：依赖因子的转录终止不依赖

因子的转录终止156DNA因子RNA聚合酶157RNA聚合酶DNAUUU……UUU……AAA……AAA……158（二）哺乳动物表达载体哺乳动物表达载体应有的结构成分：原核细胞克隆载体应有元件真核生物复制起始点选择标记性基因真核表达元

件159真核表达元件启动子/增强子多克隆位点终止信号加尾信号1601、启动子和增强子原核生物启动子和增强子在哺乳动物细胞内不起作用。真核表达载体必须有真核启动子和增强子。常用的有：161（1）病毒源启动子和增强子SV40病毒早期

基因启动子和增强子Rous肉瘤病毒基因长末端重复顺序。人类巨细胞病毒启动子腺病毒晚期基因启动子162（2）真核细胞源启动子和增强子肽链延长因子基因启动子-肌动蛋白启动子热休克蛋白启动子肌酸激酶启动子金属硫蛋白启动

子1632、终止信号和加尾信号真核细胞的转录终止终止机制是转录越过修饰点后，在修饰点处切断，随即加入polyA。基因工程中最常使用的加尾信号序列来自于SV40病毒。164转录终止修饰点165第三节重组DNA技术的基本过程166

重组DNA技术的基本过程制备目的基因选择和制备载体目的基因与载体的连接将重组DNA分子导入宿主细胞筛选和鉴定目的基因目的基因的克隆和表达167一、目的基因的制备（一）用基因组DNA制备目的基因1、建立基因组文库基因组文库的概念：首先用限制酶将基因组DNA切成

片段，再把每一DNA片段都与一个载体连接成重组DNA分子。将所有的重组DNA都转移入宿主细胞内并进性扩增，得到分子克隆的混合体。这一混合体称为基因组文库。168提取基因组DNA限制酶酶切基因组DNA酶切DNA片段与质粒载体连接转移入大肠杆菌进行克隆1692、从基因组文库中获取目的基因从细胞中分

离高分子量DNA限制酶消化分离所需要的DNA片段170（二）mRNA逆转录生成的cDNA作为目的基因1、建立cDNA文库cDNA文库的概念：首先把细胞中分离出的所有mRNA逆转录成各种cDNA，再把每一cDNA都与一个载体连接成重组DNA分子。将所有的重组DNA都转移入宿

主细胞内并进性扩增，得到分子克隆的混合体。这一混合体称为cDNA文库。171从细胞中分离出mRNA逆转录生成cDNA与载体连接成重组DNA转移入大肠杆菌进行克隆合成双链DNA逆转录酶T4DNA聚合酶1722、从cDNA文库中获取目

的基因从细胞中分离重组DNA限制酶消化分离所需要的DNA片段173（四）制备用于表达的基因片段1、直接用限制酶切取从基因组DNA从基因组文库从cDNA文库2、PCR体外扩增3、化学合成174二、载体的选择和制备三、目的基因与载体的连接（一）粘性末端连接法5`---GAATTC---3`3`--

-CTTAAG---5`5`---GAATTC---3`3`---CTTAAG---5`EcoRⅠDNA连接酶175连接酶限制酶176（二）利用人工接头连接限制酶限制酶177连接酶178179（三）加入同聚体尾连接限制酶GGGGCCCCGGGGCCCCGGGGCCCC

GGGGCCCC末端转移酶酶180GCCCCGGGGCGCCCCGGGGC限制酶连接酶181（四）平端连接限制酶T4连接酶182四、重组DNA分子导入宿主细胞常用方法（一）转化（transformation）概念：转化是指将质粒或其它外源D

NA导入原核细胞的过程。（1）CaCl2处理（制备感受态细胞）后转化（2）电穿孔法（电击法）183（二）转导（transduction）概念：由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程称为转导。噬菌体和粘性质粒体外包装法（三

）转染（transfection）概念：外源DNA分子导入真核细胞的过程称为转染。184五、目的基因的筛选和鉴定（一）遗传学方法1、筛选转化菌常利用质粒的抗生素抗性基因来筛选。185质粒载体（Ampr）+大肠杆菌（含目的基因）转化已转化的

大肠杆菌未转化的大肠杆菌在含氨苄青霉素培养基中培养生长被杀死1862、筛选带有重组体的克隆（1）插入灭活法AmprTetr目的基因AmprTetr插入灭活四环素抗性基因pBR322BamHⅠ187（2）-互补-半乳糖苷酶

5-溴-4氯-3-吲哚--D-半乳糖苷（X-gal）蓝色物质188多克隆位点启动子裂开的N端裂开的N端外源DNA−半乳糖苷酶N端编码序列pUC182686bppUC182686bp染色体重组体pUC18细菌

在含X-gal和乳糖操纵子诱导剂的琼脂上培养细菌在含X-gal和乳糖操纵子诱导剂的琼脂上培养pUC18含重组体pUC18的白色菌落蓝色菌落含载体pUC18的蓝色菌落−半乳糖苷酶C端编码序列转化转化图15-9利用互补原理筛选

重组子pUC18amprampr189蓝白斑筛选重组质粒190（二）免疫学方法（三）核酸杂交法（四）PCR技术（五）酶切鉴定191硝酸纤维膜复制培养溶菌、中和蛋白酶处理漂洗、烘干1、32P探针2、放射自显影鉴定克隆（含感兴趣DNA）图15-10原位杂交硝酸纤维膜菌落琼脂培养

板192PCR鉴定重组质粒193第四节真核细胞转染194一、真核细胞转染的基本方法（一）磷酸钙共沉淀法（二）电穿孔法（四）脂质体介导基因导入（五）显微注射法（六）CaCl2处理后转染195196197198199二、转染细胞的筛选（一）tk-细胞突变株筛选转染细

胞HAT选择法tk-细胞tk+质粒转染tk+细胞HAT培养基生长200（二）筛选转染细胞常用的抗性基因：新霉素抗性基因（neor）,此基因对氨基糖苷抗生素G418有抗药性潮霉素抗性基因氨甲蝶呤抗性基因氨基蝶呤抗性基因霉酚酸抗性基因201第五节克隆基因的表达2

02一、克隆基因在大肠杆菌中的表达在大肠杆菌中表达外源基因，主要考虑的要素有：1、目的基因2、载体3、目的基因与载体的连接4、受体菌株和诱导条件203二、克隆基因在哺乳动物细胞中的表达三、克隆基因在其它表达系统中的表达（一

）昆虫表达系统（二）酵母表达系统204真核表达体系如：酵母、昆虫、哺乳动物细胞表达系统优点：能转录后加工，即能剪接内含子；能翻译后加工，即能糖基化修饰等；通常不形成包涵体，能正确折叠。缺点：但技术难度较大，成本较高，表达量较低。205第九章DNA序列测定DNAsequenci

ng206第一节Sanger双脱氧链终止法Dideoxychaintermination207一、Sanger双脱氧链终止法原理双脱氧终止法是由Sanger于1977年建立的DNA序列测定方法，也称为引物合成法或酶促合成法。原

理208反应物：（1）待测DNA模板，可以是单链也可以是双链。（2）DNA聚合酶Ⅰ常用Klenow片段催化特点：①模板为DNA；②原料为dNTP；③存在引物的3`-OH；④遵守碱基配对原则；⑤合成方向5`3

`；⑥校读作用。209（3）原料——dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）。其中一种带32P或35S放射性标记。（4）脱氧核苷酸链延伸的特异性终止剂——2`，3`-双脱氧核苷三磷酸（2`，3`-dideoxyn

ucleosidetripsphate,ddNTP）210NHHPPPOOOOOOHOHOHHO2`-脱氧核苷三磷酸（dNTP）OOHHHHOCH2A、G、C或T211NHHPP32POOOOOOHOHOHHO-32P-dNTPOOHHHHOCH2

A、G、C或T212NHHPPPOO35SOOOHOHOHHO-35S-dNTPOOHHHHOCH2A、G、C或T213NHHPPPOOOOOOHOHOHHO2`，3`-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）OHHHHOCH2A、

G、C或T214（5）引物——一段寡核苷酸片段反应过程：（1）引物的结合引物（其5`-末端带有标记）与模板DNA3`端互补结合；GATCCCTGAGTAGTCACCTAG-OH引物结合部位引物3`5`5`3`215（2）模板链互补链的合成在DNA聚合酶Ⅰ（或Klenow片段）的催化

下，按碱基配对原则，逐个将dNTP加到引物的3`-OH端，合成模板链的互补链；3`5`GATCCCTGAGTAGTCACCTAGGGACTCATC-OH5`3`216（3）脱氧核苷酸链延伸的终止在实验中设4组反应体系，每一体系中加入4种d

NTP混合物和一种ddNTP。反应时，ddNTP和dNTP会竞争掺入新生DNA链中，使DNA链延伸终止，并以ddNTP结尾。由于ddNTP比例较低，所以终止位点是随机的。经过适当的温育之后，将会合成不同长度的DNA片段。217在含ddATP的反应管中，DNA片段均以ddATP结尾。同理，含

ddGTP、ddCTP或ddTTP的反应管中，DNA片段分别以ddGTP、ddCTP或ddTTP结尾。218CTAGGGACTAGGGACTCACTAGGGACTCATCACTAGGGACTCATCAGTG5`3`3`3`3`5`5`5`dAT

P、dGTPdCTP、dTTPddATPGATCCCTGAGTAGTCACCTAG-OH3`5`5`3`Klenow219（4）合成产物的电泳分离将上述4个反应混合物平行加到同一变性聚丙烯酰胺凝胶的4个相邻

的泳道上作电泳分离。分辨率可达1bp。（5）放射性自显影。（6）从胶片上，直接读出单链DNA的核苷酸顺序。220反应物AGCT模板DNA++++引物++++4种dNTP++++ddNTPddATPddGTPddCTPddTTPKlenow++++Buffer、ion++++

反应过程及生成物：设4组反应体系，组成如下：221CTAGGGACTAGGGACTCACTAGGGACTCATCACTAGGGACTCATCAGTG5`3`3`3`3`5`5`5`dATP、dGTPdCTP、dTTPddATPGATCCCTGAGTAGT

CACCTAG-OH3`5`5`3`A组Klenow222AAACTAGGGA3`CTAGGGACTCA3`CTAGGGACTCATCACTAGGGACTCATCAGTGmarkerAA组的电泳结果223CTA

GGCTAGGGCTAGGGACTCATCAGCTAGGGACTCATCAGTG5`3`3`3`3`5`5`5`dATP、dGTPdCTP、dTTPddGTPGATCCCTGAGTAGTCACCTAG-OH3`5`5`3`G组Klenow224GGGCTAGG3`CTAGGG3`

CTAGGGACTCATCAGCTAGGGACTCATCAGTGmarkerGG组的电泳结果G225CTAGGGACCTAGGGACTCCTAGGGACTCATCCTAGGGACTCATCAGTG5`3`3`3`3`5`5`5`dATP、dGTPdCTP、dT

TPddCTPGATCCCTGAGTAGTCACCTAG-OH3`5`5`3`C组Klenow226CCCCTAGGGAC3`CTAGGGACTC3`CTAGGGACTCATCCTAGGGACTCATCAGTGmarkerCC组的电泳结果227CTAGGGACTCTAGG

GACTCATCTAGGGACTCATCAGTCTAGGGACTCATCAGTG5`3`3`3`3`5`5`5`dATP、dGTPdCTP、dTTPddTTPGATCCCTGAGTAGTCACCTAG-OH3`5`5`3`T组Klenow228TTTCTAGGGACT3`CTAGGGACT

CAT3`CTAGGGACTCATCAGTCTAGGGACTCATCAGTGmarkerTT组的电泳结果229TTTCCCGGGGAAA45678910111214151617markerTAGC电泳方向230GATCCCTGAGTAGTCAC3`5`5`3`CTAGGGACTCA

TCAGTG231二、DNA序列测定的策略（一）末端终止法常用试剂1、载体（1）M13噬菌体载体。用于单链模板的克隆和测序（2）pUC质粒载体。用于双链模板的克隆和测序。2、通用引物（一般含15~30bp）232通用引物载体DNA互补序列待测DNA合成新链载体

DNA互补序列通用引物合成新链2334、放射性标记目前常用的是[35S]-dATP5、DNA聚合酶（1）Klenow片段（2）测序酶（sequenase)目前用的是测序酶2.0版（3）TaqDNA聚合酶234二、大片段DNA序列测定的策略1、随机法（或称鸟枪法）

大片段DNA超声波、核酸酶限制酶DNA测序235123451223234345片段序列重叠排列2362、嵌套缺失法（或互套缺失法）插入片段+载体5`凸出端3`凸出端（1）限制酶切割两种限制酶237（2）外切核酸酶Ⅲ切割外切核酸酶Ⅲ核酸

酶SⅠ238（3）克隆T4DNA连接酶239（4）测序2403、引物延伸法4、限制性片段亚克隆法241第二节Maxam-Gilbert化学修饰法242一、MaxamGilbert化学修饰法的原理化学降解法是由Maxam和Gilbert于

1977年建立的DNA测序法。其原理是：（1）放射性同位素标记待测DNA末端（3`端或5`端）。（2）化学试剂裂解标记的DNA分子。243GG+AC+TC硫酸二甲酯甲酸肼肼（加盐）鸟嘌呤甲基化脱嘌呤作用嘧啶开环胞嘧啶开环六氢吡啶六氢吡啶六氢吡啶六氢吡啶G

G和AC和TC反应体系碱基修饰试剂碱基修饰反应主链断裂试剂断裂点化学裂解反应体系244用4组化学试剂裂解末端标记的DNA分子，其中每一组化学试剂特异地针对一种或一类碱基进行切割，由此产生的4组裂解产物均为不同长度的DNA片段的混合

物。每一组反应产物中都有一套带相同标记末端的长短不一的DNA片段。245（3）高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离裂解产物（4）放射性自显影，从胶片上直接读出DNA的碱基序列5`-GATCACTACGT-3`标记5`-GATCACTACGT-3`2465`-GAT

CACTACG5`-GG裂解G5`-GATCACTACGT-3`1234567891011GGmarker2475`-GATCACTACG5`-GATCACTA5`-GATCA5`-GA5`-GG+A12345678910115`-GATCACTACGT-3`裂

解G+AG+AG+AG+AG+AG+Amarker2485`-GATCACTACGT5`-GATCACTAC5`-GATCACT5`-GATCAC5`-GATC5`-GATC+T5`-GATCACTACGT-3`裂解12345678

91011C+TC+TC+TC+TC+TC+TC+Tmarker2495`-GATCACTAC5`-GATCAC5`-GATCC12345678910115`-GATCACTACGT-3`裂解

CCCCmarker2501234567891011C+TGG+ACGATCACTACGTmarker5`-GATCACTACGT-3`251二、MaxamGilbert化学修饰法的特点1、不需酶催化的延伸反应，

未经克隆DNA片段可直接测序。2、对于含稀有碱基或G+C含量较高的DNA片段，以及寡核苷酸片段，化学修饰法优于双脱氧末端终止法。3、标记可在5`端，也可在3`端，可同时从两个方向测定同一条DNA，测定结果可以互相参照。252DNA测序的其它方法1、PCR测序法2、银染色法3、地高辛、生物素标记测

序法全自动激光荧光DNA测序253第十章核酸分子杂交技术Nucleicacidhybridization254第一节核酸分子杂交技术的基本原理255一、核酸分子杂交的概念核酸分子杂交是指来源不同的具有互补序列的两条核酸单链，在一定条件下，按碱基配对原则结

合成杂化双链的过程。杂交的双方分别称为探针（即杂交体系中的已知核酸序列）和待测核酸，杂交后形成的异源双链分子称为杂交分子。256探针：是指能与核酸分子中特定片段互补结合并带有可检测标记的核酸分子或寡核苷酸片段。探针的主要用途是

：（1）从基因文库中筛选特定克隆，获得某一重组体。（2）确定基因组中的同源序列。（3）基因在染色体上的定位。（4）基因诊断（5）法医学中的应用（）其它257核酸分子杂交过程一般需要经历了核酸的变性和复性两个阶段。变性

复性、杂交复性、杂交258二、核酸的变性与复性（一）DNA的变性（denaturation）1、概念DNA分子在某些理化因素的作用下，其两条互补链之间的氢键发生断裂，双螺旋结构松开分成两条单链。这一过程，称为DNA变性。259DNA变性的常用方法热变性酸

碱变性化学试剂变性2、DNA变性的常用方法260（1）热变性305070901001.51.41.31.21.10DNA热变性曲线A260ºCTm261增色效应：核酸分子在变性过程中，其溶液的A260会增大，此现象称为增色效应。融解温度（melt

ingtemperature,Tm）：DNA分子热变性程度达到50%时所对应的温度，称为融解温度或解链温度。262Tm的影响因素：①DNA分子的碱基组成Tm与DNA分子碱基组成的关系Tm=(G+C)%0.41+69.3从上述关系可看出，DNA变性解链是一

个区域一个区域发生的，AT富集区先解链，GC富集区后解链。因此，DNA变性曲线应是阶梯式的。263②溶液的离子强度一般情况下，在低离子强度溶液中，DNA的Tm较低，且解链温度范围较宽；在高离子强度溶液中，Tm较高，解链温度范围较窄。264③pH一般情况下，核酸溶液的pH在5~9范围内，DN

A的Tm变化不明显；当溶液的pH<4或>11时，DNA的Tm会降低。④变性剂变性剂可降低DNA的Tm265（2）酸碱变性核酸溶液pH<3或>10时，核酸分子的双链完全打开。常用碱变性法。（3）化学试剂变性常用的化学试剂有：尿素、甲酰

胺、甲醛等。2663、变性DNA分子理化性质的变化：（1）黏度降低（2）密度增加（3）沉降系数增加（4）A260吸光度值增加（5）细菌转化能力消失267（二）DNA的复性（renaturation）1、概念变性DNA的两条互补单链，在适当条件下,重新结合恢复双螺旋结

构的过程，称为DNA的复性。2682、影响复性或杂交的因素（1）核酸分子的浓度和长度核酸复性反应方程式：dC/dt=kC2当T=0时，C=C0，则：C/C0=1/(1+kC0t)当t=t1/2时,C/C0=0.5，则：C0t1/2=1/k269在杂交反应过程中，探针的浓度和长度

通常是：浓度：0.1~0.5g长度：50~300bp270（2）温度一般情况下，复性温度=Tm–20ºC~25ºC寡核苷酸探针杂交反应通常在Tm–5ºC下进行。271确定杂交反应温度时应考虑以下几点因素：①Tm每降低1~1.5ºC，错配率增加1%；②RNA-DNA杂交体的稳定性较DNA-D

NA杂交体高，Tm应相应增加10~15ºC；③采用RNA探针时，加入适量的甲酰胺，以降低Tm;④寡核苷酸探针的Tm：Tm=4(G+C)%+2(A+T)%272（3）离子强度（4）甲酰胺（5）核酸分子的复杂性（6）非特异性杂交反应常用非特异性位点封闭物：①变性的非特异性DNA：如鲑鱼

精子DNA，小牛胸腺DNA②高分子化合物：如Denhardt溶液，脱脂奶粉273第二节核酸分子杂交技术的基本方法274Southern印迹杂交Northern印迹杂交斑点和狭缝印迹杂交原位杂交核酸分子

杂交技术的基本方法275一、Southern印迹杂交Southern印迹杂交是一种DNA与DNA的分子杂交法。（一）待测DNA样品的制备1、提取待测DNA2、限制酶消化DNA（二）电泳分离酶切DNA片段常用电泳方法：琼脂糖凝胶电泳非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳276（三

）凝胶中核酸变性1、碱变性2、中和处理（四）Southern转膜1、常用的固相支持物：硝酸纤维素膜，尼龙膜，化学活化膜、滤纸等。2、常用的转膜方法277（1）毛细管虹吸印迹法湿滤纸缓冲液滤纸桥凝胶硝酸纤维素膜吸水纸纸玻璃板支持台容器重物278（2）电转移印迹法尼龙膜凝胶滤纸海绵凝胶支持夹缓

冲液电极+–滤纸电极279（3）真空转移法（五）制备探针（六）Southern杂交1、预杂交2、杂交（七）杂交结果的检测1、放射性自显影2、非放射性标记物显色280二、Northern印迹杂交Northern印迹杂交是一种应用探针检测RNA的分子杂交法。Northern印迹杂

交的基本原理和方法与Southern印迹杂交大致相同。只是在以下几点有所不同。281Northern印迹杂交靶核酸RNADNA电泳变性电泳非变性电泳转膜毛细管虹吸毛细管虹吸法转移前法转移前无须中和须中和Southern印迹杂交两种印迹杂

交法的不同点282三、斑点和狭缝印迹杂交（dotblot）即将RNA或DNA变性后，直接点到硝酸纤维素膜上，然后与探针进行固-液相杂交。283四、原位杂交（insituhybridization）即将细胞涂片或组织切片适当处理后，用探针直接与细胞或组织中的核酸进行杂交。284285

原位杂交的基本方法1、细胞或组织的固定2、组织细胞杂交前的预处理3、制备探针4、杂交5、杂交结果的检测286第三节探针的标记287一、探针的种类1、cDNA探针2、基因组DNA探针3、寡核苷酸探针4、RNA探针288二、标记物（一

）核素标记物32P、35S、3H（二）非核素标记物1、半抗原：生物素、地高辛。2、配体：生物素3、荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明4、化学发光探针289三、标记方法标记方法化学法酶法缺口平移法随机引物法PCR标记法末端标记法125I标记法光敏生物素标记法290（一）缺口平移

法DNaseⅠ；Mg2+DNA聚合酶[-32P]-dCTP;dNTP291（二）随机引物法变性、结合引物延伸[-32P]-dCTP;dNTP变性、提取292四、探针的纯化1、乙醇沉淀法2、Sepha

dexG-50柱层析法3、微柱离心法293第十一章核酸的体外扩增294第一节聚合酶链反应PolymerasechainreactionPCR295一、PCR的基本原理（一）概念在试管中，利用DNA聚合酶、一对引物和四种dNTP，对模板DN

A反复多次地进行复制，从而得到大量扩增产物的反应过程，称为PCR。296（二）PCR的基本反应1、变性：加热至95ºC左右，使模板DNA变性。2、退火：降低温度至等于或小于引物Tm时，引物与模板DNA的互补

区结合。3、延伸：温度在70ºC左右时，TaqDNA聚合酶从引物3`端催化复制链以5`——3`方向延伸。297以上三步反应为一个循环，每一循环的产物作为下一个循环的模板，如此循环30~40次。在理论上，P

CR的扩增产物可达到2n（n=循环次数）。如，循环次数为30，则扩增产物的拷贝数为230298变性退火延伸299300301302（三）PCR技术的基本步骤1、制备模板DNA2、PCR循环反应3、PCR产物的

检测（1）电泳分离PCR产物（2）染色及检测303二、PCR引物的设计基本要求：1、引物的长度一般为15~30bp2、引物的碱基成分应尽量随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶堆积的现象。3、引物不应有自身互补序列。4、两个引物之间不存在互补序列。3045、引物与非特异区序列的同源性应小于70%

。6、引物3`端碱基以G或C为好。7、引物5`端可修饰305三、PCR反应条件的控制（一）PCR反应的缓冲液通常含有：10~50mmol/LTris-HCl（室温pH8.3~8.8；72ºC时，pH7.2）50mmol/LKClBSA甲酰胺306（二

）镁离子浓度一般为1.5mmol/L（三）dNTP浓度一般为20~200mol/L307（四）TaqDNA聚合酶特点：1、耐热2、最适温度：75~80ºC3、催化活性：聚合活性、5`—3`外切核酸酶活性（但

缺3`—5`外切核酸酶活性）、逆转录酶活性、末端转移酶活性。用量：308（五）引物浓度一般为0.1~0.5mol/L（六）反应温度和循环次数1、变性温度和时间2、退火温度和时间3、延伸温度和时间4、循环次数309四、PCR实验中的注意事项1、防污染（1）设置不同的操作区（2）分装试剂（3）严

格操作过程2、设对照（1）阳性对照（2）阴性对照（3）试剂对照310五、PCR的主要类型（一）筑巢PCR先用一对外侧引物扩增含目的基因的大片段DNA，再用一对内侧引物以大片段DNA为模板扩增目的基因。311312313（二）共享引物PCR利用三对引物扩增两种不同的DNA序列，

其中一条引物与两种待扩序列都互补，它另两条引物分别组成两对PCR引物。共享引物BA314（三）多重PCR在一次反应中加入多对引物，同时扩增一个DNA分子中不同序列的PCR。ABC315（四）不对称PCR（五）锚定PCR（六）反向PCR（七）彩色PCR（八）原位PCR（九）定

量PCR（十）差异显示PCR（十一）重组PCR316第十二章转基因生物和基因打靶317第一节转基因动物Transgenicanimal318一、概述转基因动物是指用人工方法将外源基因导入或整合到动物基因组内，并能稳定传代的一类动物。319二、基本原理将目的基因导入实验动物的受精卵

或着床前胚胎细胞中，使目的基因整合到基因组中，然后将此受精卵或胚胎细胞移植入受体动物的输卵管或子宫内，使其发育成携带有目的基因的转基因动物。320小鼠交配从输卵管中取出受精卵精子卵子前核受精卵目的基因用显微注射法在前核内注入外源DNA用

吸管固定卵细胞321把受精卵细胞移植于借腹怀孕的雌小鼠借腹怀孕雌小鼠新生小鼠DNA分析PCR显示转基因的存在用显微注射法产生转基因小鼠322克隆DNA供体母鼠目的基因DNA片段受精卵注射DNA的受精卵假孕母鼠娩出幼鼠酶解、分离纯化、定量取出胚胎传代转基因鼠制备DNA

外源基因的整合检测确定转基因鼠幼鼠尾取幼鼠血检测表达水平移入输卵管或子宫注射激素，与公鼠交配制备DNA、蛋白质显微注射323三、基本方法（一）外源基因的组成和制备1、组成（1）目的基因（2）调控元件（顺式作用元件）（3）报告基因2、

制备324（二）外源基因导入受精卵或胚胎细胞的常用方法1、显微注射法2、胚胎干细胞法3、逆转录病毒感染法4、精子载体法325（三）外源基因的检测1、染色体和基因水平的检测（1）DNA斑点杂交（2）South

ern印迹杂交（3）PCR2、转录水平的检测（1）Northern印迹杂交（2）RNase保护分析（3）RT-PCR3、蛋白质水平的检测Western印迹杂交326四、转基因动物的应用（一）基因组织或阶段特异表达的研究；（二）基因功能的研究；（三）寻找新基因；（四）胚胎期表达基因功能的研究；（五

）建立外源基因表达、调控的动物模型；327（六）遗传疾病的研究；（七）建立人类疾病的动物模型；（八）培育动物新品种；（九）基因产品的制备；（十）免疫学中的应用。328第二节转基因植物Transgenicpla

nt329一、基本方法（一）将目的基因克隆到表达载体上；（二）培养受体细胞如植物愈创组织、植物悬浮细胞、无菌苗等。（三）将目的基因导入受体细胞330常用导入方法1、农杆菌介导的基因转移法2、植物病毒介导的基因转移法3、电击法4、基因枪法5、显微注射法6、

脂质体介导法7、多聚体介导法8、激光微束穿孔法331（四）适当培养转化细胞（五）筛选阳性转化细胞（六）培植阳性转化植株（七）转基因植株的鉴定332转基因细胞和植株的筛选与鉴定方法：1、标记基因筛选法。如抗生素抗性基因、抗除草剂基因、报告基因等。2、分子生物学技术

。如Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、Western印迹。333二、转基因植物在医学中的应用（一）研制疫苗（二）生产单克隆抗体334第三节基因打靶Genetargeting335一、基因打靶的概念通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在

生物活体内研究此基因的功能。这一技术称为基因打靶。若定向敲除某个基因，称为基因敲除（geneknockout）；若定向将一段基因序列替代另一段基因序列，则称为基因敲入（geneknockin）。336二、基因打靶的必要条件1、

胚胎干细胞2、打靶载体打靶载体中的必要成分：（1）载体DNA（2）目的基因同源片段（3）筛选标志基因①neu（新霉素）阳性筛选标志基因；②HSV-tk阴性筛选标志基因。337二、基因敲除的基本程序（一）构建打靶载体1、

获得目的基因的同源片段，将此片段克隆到一般的质粒载体中；2、从重组质粒中切除目的基因的大部分同源DNA序列，只留部分序列在线性质粒载体的两端；3383、将neu基因克隆到带有目的基因同源序列的线性质粒中，使之

位于残留目的基因同源序列的中间；4、在目的基因同源序列的外侧线性化重组质粒载体，将HSV-tk基因克隆到此线性载体中。339（二）打靶载体导入ES细胞（三）基因敲除ES细胞注射入胚泡（四）胚泡植入假孕的小鼠子宫中（五）嵌合体的杂交育种340同源

基因片段线性质粒载体重组质粒部分同源序列构建在载体上neu基因HSV-tk341打靶载体导入ES细胞ES细胞培养ES细胞注射入胚泡植入子宫假孕小鼠嵌合体小鼠基因敲除小鼠正常小鼠正常小鼠正常小鼠交配342二、基因打靶在医学中的应用1、基因打靶与遗传病2、基因打靶与肿瘤研究3、基因打

靶与生物制药343第十三章DNA芯片技术DNAchips344第一节概述345一、生物芯片的概念：生物芯片是指通过微电子、微加工技术在平方厘米大小的固体介质表面构建的微型分析系统，以实现对组织细胞中DNA、蛋白质和其他生物成分的快速、高效、敏感的处理与分析。346二、生物芯片的类型：生物芯片DN

A芯片蛋白质芯片组织芯片细胞芯片其它芯片样品制备芯片核酸扩增芯片毛细管电泳芯片微缩芯片实验室347三、DNA芯片的类型：（一）按芯片制备方法分类：DNA芯片原位合成芯片（syntheticgenechip）DNA微阵列芯片（DNAmicroarray）348（二）按探针分类：DNA芯片寡核苷

酸阵列（芯片）DNA阵列基因芯片cDNA芯片RNA芯片349原位合成芯片与DNA微阵列芯片的比较原位合成芯片DNA微阵列芯片制作方法原位化学合成收集探针、显微打印探针类型寡核苷酸cDNA、基因片段、寡核苷酸、RNA等探针长度短，小于50n

t较长，100~500nt或更长最高集成度10~401~10万点阵/cm2万点阵/cm2专利保护专利控制严格无专利控制350第二节DNA芯片的基本原理与方法351DNA芯片技术流程图芯片制作样品的制备显微光蚀刻压电打印分子打印原位

合成芯片探针设计与制备支持物预处理探针打印探针固化DNA微集阵列样品核酸的提取与纯化扩增与标记标记样品的纯化杂交及杂交后清洗扫描与分析一、芯片的制备352（一）生物芯片支持物的预处理1、实性材料支持物的预处理硅片、

玻璃片、瓷片、聚丙烯酰胺凝胶、聚苯乙烯微珠、磁性微珠等。预处理：表面衍生出羟基、氨基等活性基团。这些基团在合成前用光敏保护基保护起来。氨基硅烷化或包被多聚赖氨酸。3532、膜性材料支持物聚丙烯膜、尼龙膜、硝基纤维素

膜、聚偏二氟乙烯膜（PVDF）等。预处理：包被氨基硅烷或多聚赖氨酸。354带负电荷表面+++++++++++++++++++固定于玻璃片上的多聚赖氨酸355-OH-OH-OH+-O-O-OSi-(CH2)

3-NH2C2H3OC2H3OC2H3OSi-(CH2)3-NH2-O-O-OSi-(CH2)3-NH-C-NH-S-NH-C-HS-NH-C-HS1,4-苯二异硫氢酸氨丙基三乙氧基硅烷玻璃片H-C-NH-S-O-O-OSi-(CH2)3-NH-C-NH-S-N

H-C-SNH-5`-DNANH-5`-DNA356OSi-(CH2)3-SHSi-(CH2)3-SHOOOSi-(CH2)3-S-S-(CH2)6-O-(PO3)-(T)10-OligomerOOSi-(CH2)3-S-S-(CH2)6-O-(PO3)-(T

)10-Oligomer玻璃片N2或真空357（二）原位合成芯片的制作1、显微光蚀刻技术T-XXOXOXOXTXTXOXCXTXTCATXCCATTCCTCCTGGC-XXOXOXOXTXTXOXOXOHOHOXOXOXOXOXO358第一轮

第二轮第三轮TCGATCGTCTTTTTCCCGGATTCTCGTCGATCGATCGATTTT3593602、压电打印法361（三）DNA微集阵列芯片的制作1、探针的制备（1）已克隆的基因片段；（2）PCR

、RT-PCR等方法扩增的基因片段；（3）人工合成的DNA片段（寡核苷酸）；（4）细胞中分离的RNA；（5）人工合成的肽核酸。362OHNOHNNNOBOOHNOBNOOBBOOBOOBOPO-OOPO-OOPO-ODNAPNA3632、探针的打印1、喷墨打印2、针式打印

3、探针的固化364二、样品的制备1、核酸样品的分离纯化2、靶DNA的扩增（PCR）3、样品核酸的标记常用标记：荧光标记物、生物素、放射性同位素。4、标记后样品的纯化365三、分子杂交杂交信号的强弱与样品中靶基因的量呈正比。杂交过程中的

位阻作用。杂交的条件：盐的浓度杂交的温度杂交时间探针的G+C含量探针所带电荷靶序列的二级结构366四、检测分析方法：激光扫描仪；激光共聚焦扫描仪。367检测器反光镜激光束荧光束光束分离器物镜支持物向四周发射的荧光发射光滤光镜检测透镜共聚焦针孔共聚焦扫描示意图368第三节DNA芯片技术

的应用369DNA芯片技术的应用DND序列测定基因表达分析基因诊断药物研究与开发其它370第十三章基因与疾病371第一节基因突变的分子机制372基因突变是指基因组中核酸分子碱基排列顺序的变异及其所引起的生物表型变化。一、基因突变的概念3

73二、基因突变的分类1、按基因突变因素分类基因突变自发突变(spontaneousmutation)诱发突变(inducedmutation)3742、按基因突变发生的细胞分类生殖细胞突变体细胞突变突变3753、按碱基序列变异情况分类（1）点突变：转换、颠换

（2）缺失突变（3）插入突变（4）倒位突变（5）动态突变376三、基因突变的分子机制（一）诱变因素能引起基因突变的理化因素或物质称为突变剂（mutagen）或诱变剂。3771、化学的：（1）碱基和核苷酸类似物。如5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤等。（2）烷

化剂。如氮芥、环磷酰胺。（3）抗生素类。如放线菌素D、丝裂霉素、博来霉素等。（4）染色剂。如吖啶黄、二氨基吖啶黄等。（5）亚硝酸盐3782、物理的：主要是电离辐射和紫外线照射。（1）紫外线（2）X线（4）、、等放射线3、生物的：（1）病

毒（2）细菌毒素（3）真菌毒素379（二）突变剂的作用机制1、碱基和核苷酸类似物诱发突变5-尿嘧啶（5-FU）NHNH=OOFNHN=OOFOOHP~P~P-CH2380NNSHNHNNNSHNNOP~P~P-CH2OH6-巯基嘌呤（6-MP）3815-溴

尿嘧啶（5-BrU）NHNH=OOBrNHN=OOBrOOHP~P~P-CH2382A5-BrUAT5-BrUG5-BrUAGC复制复制383胞嘧啶核苷酸脱氨转变为尿嘧啶核苷酸+NH3+H2O亚硝酸盐2、改变DNA的化学结

构（1）亚硝酸盐诱发突变ONNRNH2ONHNRO384CH3CH35-甲基胞嘧啶核苷酸脱氨转变为胸腺嘧啶核苷酸+NH3+H2O亚硝酸盐ONNRNH2ONHNRO385腺嘌呤核苷酸脱氨转变为次黄嘌呤核苷酸NH2NNRNNOH亚硝酸盐+NH3+H2ONNRNN386OH鸟嘌呤核苷酸脱氨转变为黄嘌

呤核苷酸H2NNNRNNOH亚硝酸盐+NH3+H2ONNRNNHO387（2）烷化剂诱发突变OHH2NNNRNNOHH2NNNRNN烷化剂烷基R7-烷基G3883、结合到DNA分子上诱发突变吖啶类（原黄素、吖黄素、吖黄）染色剂诱发突变

吖啶类物可嵌入DNA分子两条链配对的碱基之间染色体不等交换插入或缺失突变3894、紫外线及其它射线引起的DNA分子变化（1）紫外线对DNA的作用嘧啶二聚体的形成390TTTTTT紫外线光复活酶(可见光)OOCH3RR紫外线光复活酶NHNOOCH

3NHNOOCH3NHNOOCH3NHNRR嘧啶二聚体的形成391胞嘧啶脱氨作用ONNR+NH3紫外线+H2ONH2ONHNRO392（2）X、、、等射线对DNA的作用①使DNA分子两条链的A-T、C-G之间氢

键断裂；②使DNA分子的碱基与糖基之间的糖苷键断裂；③形成嘧啶二聚体。393三、基因突变的遗传效应及后果（一）基因突变的遗传效应1、遗传密码的改变错义突变无义突变同义突变移码突变394（1）错义突变（missensemutation)在基因的编码序列中，由于碱基

的替换，使编码某一氨基酸的密码子变为编码另一氨基酸的密码子，这种突变称为错义突变。395正常顺序UAC-AGU-CCU-ACA-GAA-AAC-GCU酪丝脯苏谷天酰丙错义突变UAC-AGU-CCU-ACA-GAA-AGC-GCU酪丝脯苏谷丝丙396（2）无义

突变（nonsensemutation)在基因的编码序列中，由于碱基的替换，使某个氨基酸密码转变为终止密码，致使肽链合成提前终止，肽链缩短，这种突变称为无义突变。397正常顺序UAC-GUC-CUA-CAG-AAG-ACG-酪缬亮谷酰赖苏CUA-TAT亮酪无义突变UAC-G

UC-CUA-CAG-UAG-ACG-酪缬亮谷酰CUA-UAU终止密码398（3）同义突变（synonymousmutation)同义突变是指基因的编码序列中碱基替换不改变遗传密码含义，因此其表达产物多肽链的氨基酸排列顺序不发生变化。399正常顺序UAC-AGU-C

CU-ACA-GAA-AAC-GCU酪丝脯苏谷天酰丙同义突变UAC-AGU-CCU-ACG-GAA-AAC-GCU酪丝脯苏谷天酰丙400（4）移码突变（frame-shiftingmutation):在基因的编码序列中,插入或缺失一个或数个(非3的整倍数)碱基,均可造成突变位点后的遗传密码阅

读框架发生改变,不能编码出原来多肽链的氨基酸排列顺序。这种突变称为移码突变。401正常顺序UAC-AGU-CCU-ACA-GAA-AAC-GCU酪丝脯苏谷天酰丙插入1个碱基UAC-AGA-UCC-UAC-AGA-AAA-酪精丝酪精赖CGC-U精402正常顺序UAC-AGU

-CCU-ACA-GAA-AAC-GCU酪丝脯苏谷天酰丙缺失1个碱基UAC-GUC-CUA-CAG-AAA-ACG-CU酪缬亮谷酰赖苏4032、mRNA剪接位点的改变基因突变可引起mRNA的剪接位点发生改变，有两种情况：①原有

剪接位点消失；②产生新的剪接位点。这两种情况均可导致mRNA的错误剪接，形成异常的mRNA,产生异常的表达产物，如多肽链的延长、变短等。404（1）一个或几个氨基酸的替换；（2）移码突变引起的多肽链氨基酸顺序的改变;（3）多肽链延长（多肽链增加了一个或数个氨基酸残基）；（4）多肽链变短（多肽链缺

失一个或数个氨基酸残基）。3、蛋白质分子结构的改变4054、蛋白质合成速率的改变:如果突变发生在基因表达调控序列或翻译调控序列内,可引起蛋白质合成速率发生变化.406（二）基因突变的后果1、基因突变与生物进化

407动物植物小麦酵母菌假丝酵母脉孢菌昆虫脊椎动物蛾蝇鱼两栖类爬虫类金枪鱼鸟类海龟响尾蛇鸭鸡企鹅哺乳类牛蛙袋鼠鲸兔猪马驴狗人猿4082、基因突变与遗传病3、基因突变与细胞癌变4、其它（1）衰老与基因突变（2）心血管疾病与基因突变（3）糖尿病与基因突变（4）线

粒体基因突变与疾病409第二节基因突变与异常血红蛋白病410主要种类（肽链组成）不同发育期胚胎期胎儿期出生后HbGower1(22)HbGower2(22)HbPortland(22)HbF(

22)HbA(22)HbA2(22)血红蛋白（hemoglobin,Hb）411412血红素4131020304050612182430366121824303642终生人体发育期间Hb肽链的演变414珠蛋白肽链基因-珠

蛋白基因家族：成簇排列在第16号染色体上。5`---2-1-2-1--3`-珠蛋白基因家族：位于11号染色体短臂。5`--G-A----3`415血红蛋白病分为异常血红蛋白病和地中海贫血

两类。异常血红蛋白病（abnormalhemoglobinsyndrome）是以Hb分子结构异常为主要分子病理改变并伴有临床表现的血红蛋白病。416异常血红蛋白病的主要类型镰刀细胞性贫血不稳定血红蛋白病血红

蛋白M病伴有红细胞增多症的异常血红蛋白病417一、血红蛋白变异的分子基础1、单碱基替代。如HbS（6GluVal）2、密码子的缺失或插入。如HbGrady（119位后增加了三个氨基酸，Phe-Thr-Pro）3、移码突变。如HbWayne（缺失一个碱基）H

bTak（插入两个碱基）4184、终止密码突变。如HbConstantSpring（珠蛋白肽链为172个氨基酸）5、融合基因。如HbLepore（）419二、不稳定血红蛋白病由于珠蛋白基因突变，使珠蛋白肽链上的氨基酸发生替换或缺失

，可导致Hb分子结构不稳定。主要成因是：1、与血红素接触的氨基酸发生了置换。4202、在螺旋段上的氨基酸发生了替代。3、11接触面上的氨基酸发生了置换。4、氨基酸缺失。421三、血红蛋白M病血红蛋白M病是一种血中含高铁血红蛋

白的异常血红蛋白病。形成高铁血红蛋白的原因是由于珠蛋白基因突变，珠蛋白肽链中某些氨基酸发生替换，造成Hb的辅基血红素处于高铁（Fe3+）状态。例如：422当珠蛋白肽链87、92或58、63的组氨酸被酪氨酸取代时，酪氨酸R基的-OH能与Fe2+形成稳定的配位键，使Hb分子

中的铁处于高铁（Fe3+）状态。HbMMilwakee：67ValGlu423四、伴有红细胞增多症的异常血红蛋白病（abnormalhemoglobinsyndromewitherythrocytosis）由于氨基酸置换使Hb分子氧亲和力提高，导致红细

胞增多。能引起Hb分子氧亲和力升高的主要情况有：1、12接触面上的氨基酸发生替换；4242、珠蛋白肽链羧基端氨基酸发生替换，影响盐桥的形成；3、氨基酸的取代影响与2，3-二磷酸甘油酸的结合；4、“血红素口袋”四周的氨

基酸被取代。425第三节基因突变与地中海贫血426地中海贫血（mediterrameananemia）或称海洋性贫血（thalassemia）（简称地贫）是一类以珠蛋白肽链合成速率降低为主的血红蛋白病。地中海贫血可

分为-地中海贫血（简称-地贫）和-地中海贫血（简称-地贫）。427一、-地中海贫血-地中海贫血是由于-珠蛋白基因的缺失或功能障碍，导致-珠蛋白肽链合成速率降低而引起的贫血病。（一）-珠蛋白基因家族：成簇排列在第16号染色体上。5`---2-1-2-1--

3`428（二）-地中海贫血的分子缺陷1、基因缺失型从单倍体考虑，-珠蛋白基因缺失可有以下两种情况：（1）两个-基因全缺失（--/），称为-地贫1或0-地贫；（2）缺失一个-基因（-/），称为-地贫2或+-

地贫。429从双倍体考虑，则可形成多种杂合子和纯合子类型。-地贫的临床分型：（1）静止型-地贫①缺失基因数目：1②基因型：+地贫杂合子（-/）③患者血中主要Hb：HbA④临床主要表现：无贫血症状4

30（2）标准型-地贫①缺失基因数目：2②基因型：0-地贫杂合子或+地贫纯合子，即（--/）或（-/-）。③患者血中主要Hb：HbA，含少量HbH（4）。④临床主要表现：贫血症状较轻。431（3）HbH病①缺失基因数目：3②基因型：0-地贫与+地贫

双重杂合子，即（--/-），或0-地贫与非缺失型地贫的双重杂合子，如（--/T）或（--/CS）。③患者血中主要Hb：含较多的HbH（4）。④临床主要表现：溶血性贫血。432（4）HbBart’s病①缺失基因数目：4②基因型：

0-地贫纯合子，即（--/--）。③胎儿血中主要Hb：HbBart’s（4）。④临床主要表现：胎儿在出生前窒息死亡。4332、非缺失型有多种，主要成因是：（1）基因突变影响mRNA的加工；（2）起始密码突变（3）终止密码突变（4）珠蛋白不稳定434二、-地中海

贫血-地中海贫血是由于-珠蛋白基因的缺陷，导致-珠蛋白肽链合成显著减少而引起的贫血病。（一）-珠蛋白基因家族：位于11号染色体短臂。5`--G-A----3`435（二）基因缺陷类型-地贫的基因缺陷主要是由于点突变或移码突变所致，单纯因-珠蛋白基因缺失的不多见

。目前发现的-珠蛋白基因缺陷型有100多种，按突变对基因表达的影响大致可分为下列六种类型：4361、转录水平降低2、RNA剪接异常3、翻译缺陷4、RNA修饰缺陷5、-珠蛋白不稳定6、基因缺失437-地贫的临床分型按-珠蛋白合成

情况分类：+-地贫0-地贫按临床症状分类：轻型-地贫重型-地贫438-类地贫的类型-地贫-地贫-地贫HPFHHblepore439第四节基因突变与血友病甲440血友病甲是一种由于凝血因子Ⅷ遗传性缺乏所致的出血性

疾病，属于X染色体连锁性遗传病。441一、凝血因子Ⅷ基因位于X染色体长臂末端二、因子Ⅷ基因缺陷1、基因缺失2、插入突变3、点突变4、基因重排442第五节基因突变与血友病乙443血友病乙是一种由于凝血因子Ⅸ遗传性缺乏所致的出血性疾病，属于X染色体连锁性遗传病。444一、凝血因子Ⅸ基因位于X染色体长臂

末端二、因子Ⅸ基因缺陷1、基因缺失2、插入突变3、点突变（1）RNA剪接位点突变（2）无意义突变（3）错意义突变445第十五章癌基因与抑癌基因446447正常细胞正调节信号（如oncogene）促进细胞增殖负调节信号（如anti-

oncogene）抑制增殖，促进分化、成熟和衰老448肿瘤相关基因•与肿瘤发生和发展密切相关的基因称为肿瘤相关基因，主要有：•癌基因•抑癌基因•肿瘤转移基因•肿瘤转移抑制基因•肿瘤细胞耐药基因•肿瘤血管生长基因•肿瘤血管生长抑制基因449第一节癌基因与抑癌基因4

50一、癌基因（一）概念癌基因是一类在正常情况下对细胞的增殖有正调控作用的，当它们结构变异或表达异常时，能诱导细胞癌变的基因。癌基因可分为病毒癌基因和细胞癌基因两类。451病毒癌基因存在于病毒基因组内的癌基因称为病毒癌基因（viruson

cogenes,v-onc）。这类病毒感染动物细胞时，可诱导动物体内肿瘤形成。452细胞癌基因存在于动物细胞中的癌基因称为细胞癌基因（cellularoncogenes,c-onc）。它们在正常情况下主要在胚胎期表达，而在出生后的个体内不表达或限量表达，主要功能

是促进细胞的正常增殖和分化，此时又被称为原癌基因（proto-oncogene,pro-onc）。当pro-onc被致癌因素激活时，可诱导细胞癌变。453癌基因的命名通常根据逆转录病毒株及其转化细胞来命名，以三个斜体小写字母表示，如：srcavianRoussarcomav

irus（鸡Rous肉瘤病毒）erbavianerythroblastosisvirus（鸡成红细胞增多症病毒）sissimiansarcomavirus（猴肉瘤病毒）454（二）癌基因家族及其表达产

物1、src家族：srcablfesfgrfpsfymlckkcklynrostklyes。产物：膜结合的Tyr蛋白激酶。455（2）ras家族：有三种成员，即H-rasK-rasN-ras。产物：P21蛋白（即分子量21kD)，也称Ras蛋白或P21ras。P21属G蛋

白类。（3）myc家族：c-mycM-mycL-mycfos。产物：核内转录因子。456（4）sis家族：只有sis一员。产物：P28。P28与DPGF同源，属生长因子类。（5）erb家族：erbAerbBfmstrk。产物：细胞骨架蛋白类。（6）myb

家族：myb和myb-ets两个成员。产物：核内转录因子。457二、抑癌基因（一）概念抑癌基因（tumorsuppressorgene）又称为抗癌基因（antioncogene）是一类在正常情况下对细胞增殖有负调控作用，而在两个等位基因都缺失或失活时可

促进肿瘤形成的基因。458基因名称RBp53APCBCNSBRCADCCDPC4P16NF1PTENnm2313q1417p135q219q1317q2118q21.318q21.19p2117q1110q23.317q22染色体定位（二）常见的抑癌基因45

9（三）抑癌基因表达的产物1、跨膜受体2、胞质调节因子或结构蛋白3、转录因子和转录调节因子4、细胞周期因子5、DNA损伤修复因子6、其他功能蛋白460第二节癌基因与抑癌基因在细胞增殖调控中的作用461一、癌基因表达产物在细胞增殖信号转导中的作用癌基因表达的主要产物：1、生长因子及其类似物。如：

癌基因表达产物sisint-2血小板源生长因子类似物成纤维细胞生长因子4622、受体类。（1）跨膜生长因子受体的蛋白酪氨酸激酶。如：癌基因表达产物erb-Bfmsneu表皮细胞生长因子受体巨细胞集落刺

激因子受体ECF受体类似物463癌基因表达产物erb-Amas甲状腺激素受体血管紧张素受体（2）可溶性蛋白酪氨酸激酶受体。如：met、trk等。（3）非蛋白激酶受体。如：4643、低分子量G蛋白。如：H-rasN-ras、K-ras4、胞内蛋白激酶（1）与膜结合的蛋

白酪氨酸激酶。如：src家族。（2）胞浆丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。如：cot、mos、pin-1、raf等。4655、胞浆调节蛋白。如：crk基因。6、核内转录因子。如：c-myc、l-myc、n-myc、lyl-1、myb等基因。466二、癌基因和抑癌基因在细胞周期调控中的作

用（一）细胞周期及其调控机制1、细胞周期G1SM4672、细胞周期的调控机制（1）细胞周期的两个主要调控点（亦称检测点checkpoint）：①G1期检测点：位于G1/S转折点处，在酵母菌中称为起点（start），在哺乳动物细胞中称为限制点，是控制细胞进入S期的检测

点。468②G2检测点：位于G2/M转折点处，是控制细胞进入M期的检测点。（2）调控机制①对G1检测点的调控469参与细胞周期调控的主要物质细胞周期素（cyclin)A、B、C、D、E细胞周期蛋白依赖激酶（cyclin-dep

endent-kinase,Cdk）1、2、3、4、5细胞分化周期调控因子（celldivisioncyclecontrol,Cdc）转录因子E2FRB蛋白470生长因子G1期诱导CyclinD表达Cdk2

Cdk4Cdk5CyclinD-Cdk2-Cdk4-Cdk5(Cdk磷酸化)CyclinE表达CyclinE-Cdk2（Cdk2磷酸化）促使细胞通过G1/S进入S期G1期诱导471CyclinA表达S期诱导CyclinA-Cdk2（Cdk2活化）E2FDN

A复制RB蛋白-PRB蛋白-E2F（E2F失活）cyclinD和E降解472②对G2检测点的调控cyclinB表达CyclinB-Cdc2(Cdc2磷酸化）细胞进入M期473（二）原癌基因在细胞周期调控中的作用474（三）抑癌基因在

细胞周期调控中的作用475第三节癌基因和抑癌基因与肿瘤发生476一、癌基因激活的机制（一）原癌基因点突变；（二）原癌基因获得外源启动子而激活；（三）原癌基因因甲基化程度降低而激活；（四）原癌基因的拷贝数增加（癌基因扩增）（五

）基因易位或重排使原癌基因活化。477二、癌基因激活与肿瘤的发生（一）肿瘤发生学说1、启动阶段在启动因子的作用下，细胞发生癌前期改变的阶段（即DNA发生改变，但细胞表型仍属正常）。启动因子是一类在启动阶段使细胞发生癌前

期改变的因素。4782、促癌阶段在启动因子和促癌因子协同作用下，使癌前细胞转变为癌细胞的阶段。促癌因子是一类在启动因子作用的基础上，使癌前细胞转变为癌细胞的因素。其本身无致癌作用。4793、演进阶段癌变细胞

进一步发展为自主分裂增殖细胞并在促癌阶段所形成的增生病灶内形成癌病灶的阶段。480（二）癌基因与肿瘤发生1、ras基因变异与肿瘤发生常见变异：12、13、61位密码子点突变。变异Ras蛋白的作用：水解GTP能力降低，促进细胞生长。相关肿瘤：结肠和直肠癌。

4812、myc基因变异与肿瘤发生常见变异：8号染色体与14号染色体与易位;基因扩增。常见相关肿瘤：Burkitt淋巴瘤，小细胞肺癌等。4823、neu基因变异与肿瘤发生常见变异：点突变；基因扩增；过表达。常见相关肿瘤

：多种。4、bcl-2基因与肿瘤发生常见变异：易位。常见相关肿瘤：结节非霍奇金淋巴瘤。4835、mdm2基因变异与肿瘤发生常见变异：高表达。常见相关肿瘤：多种。484三、抑癌基因失活与肿瘤发生1、Rb基因常见变异类型：缺失突变、其他突变。常见

相关肿瘤：多种。4852、p53基因常见变异类型：缺失突变、点突变、移码突变、基因重排。常见相关肿瘤：多种。p53的功能：（1）抑制cyclinA的表达；（2）抑制DNA聚合酶与DNA复制起始复合物的结合；（3）激活抑制细胞分裂的基因；（4）抑制癌基因对细胞的转化。4863、p16基因常见突变类型

：基因缺失。常见相关肿瘤：多种。p16的功能:与Cdc4结合，抑制其活性。487四、肿瘤发生中的多基因协同作用（一）癌基因之间的协同作用（二）癌基因与抑癌基因之间的协同作用。488第十六章基因诊断Genediagnosis489基因诊断的概

念：基因诊断是以DNA和RNA为诊断材料，通过检查基因的存在、缺陷或表达异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法。490基因诊断方法主要用于诊断下列两种类型疾病：1、人体自身基因的突变基因结构的异常基因表达的异常2

、外来生物的入侵基因突变491第一节基因诊断的技术方法492一、基因诊断中常用的分子生物学技术（一）核酸分子杂交（二）聚合酶链反应（PCR）（三）单链构象多态性检测（四）限制酶酶谱分析（五）DNA序列测定（六）DNA芯片技术493二、基因诊

断的基本方法（一）基因突变的诊断1、点突变的诊断（1）诊断已知的点突变常用检测方法：①PCR-ASO②DNA芯片技术③限制性片断长度多态性分析法④等位基因特异PCR（ASPCR）494①PCR-ASO探针

法聚合酶链反应polymerasechainreaction（PCR）等位基因特异性寡核苷酸allelespecificoligonucleotide（ASO）495Ⅰ、基本原理首先对野生型基因和突变型基因的特定片段分别进行PCR，然后在高特异性

条件下，用人工合成的一对等位基因特异性寡核苷酸探针对PCR扩增产物进行杂交，其中一个探针能与突变基因特异性互补结合，而另一探针能与正常基因特异性结合，以此来确定突变基因。496Ⅱ、基本方法（Ⅰ）设计和合成寡核苷酸探针（

Ⅱ）制备DNA样品（Ⅲ）PCR（Ⅳ）杂交（斑点杂交）（Ⅴ）显示结果497正常基因：GGTACGATGCGGTTAACGCGCCATGCTACGCCAATTGCGC突变基因：GGTACGATGTGGTTA

ACGCGCCATGCTACACCAATTGCGC设计寡核苷酸探针N设计寡核苷酸探针M498MNMNMNMN499杂交的结果：（Ⅰ）受检者DNA与M杂交，与N不杂交：突变基因纯合子（Ⅱ）与M、N都能杂交：突变基因杂合子（Ⅲ）N杂交，与M不杂交：没有这种突变基因（Ⅳ）M、N均不杂交：可能是

新突变500②DNA芯片技术ATCGATCGATCGATCGATCG探针定位CT（纯合子）CT（杂合子）CG（新突变）CA（新突变）ATCG正常501（2）诊断未知的点突变常用检测方法：①PCR-SSCP②DNA芯片③测序5

02①PCR-SSCP检测法单链构象多态性SinglestrandconformationpolymorphismSSCP503基本原理单链DNA在中性溶液中可形成一定的空间构象，这种空间构象与其碱基顺序相关。因此当单链DNA中碱基发生变异时，如碱基替换，它的空间构象也发生一定变化。

这种单链DNA因碱基变异而引起的空间构象变化的现象称为单链构象多态性。504单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，其迁移率不仅与链长有关，还与单链DNA的空间构象有关，因此碱基变异引起的构象变化也可改变单

链DNA的电泳迁移率。利用这种原理可将野生型DNA和突变型DNA区分开来。505ssDNAdsDNAdsDNA高温变性，快速冰浴dsDNAssDNA野生型DNA突变型DNASSCP原理示意图慢快506PCR-SSCP的基本方法制备DNA样品PCRPCR产物热变性、快速冰浴非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳显

示结果5072、少数核苷酸缺失或插入突变的诊断方法同点突变的诊断5083、大片断缺失或插入突变的诊断常采用PCR法致病基因引物1引物2引物3引物45094、基因重排（染色体易位）的诊断常采用PCR法引物1引物2引物35105、基因扩增的诊

断常采用Southern印迹杂交定量法511（二）多态性分析基因组的核酸分子碱基排列顺序在同种生物的不同个体之间或等位基因之间存在差异的现象称为基因多态性。DNA多态性可分为位点多态性和重复序列多态性两种。5121、限制性片段长度多态

性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）分析513DNA分子中某些碱基的变异（即位点多态性）可使某种限制性核酸内切酶的切点消失或出现新的切点，因此用同一种限制性核酸内切酶消化不同个体的DNA分

子时，会产生各不相同的限制性片段类型。这种现象称为限制性片段长度多态性。514限制酶酶切位点的改变造成的RFLP可分为两种情况：①限制酶识别位点发生单个碱基置换，导致酶切位点消失或获得，此称为点多态性。这种态性只有两个等位片断，即多态位点的有

或无。515②限制酶识别位点之间的DNA序列缺失、插入或重组，限制酶识别序列不发生变化，但它在基因组中的位置发生了变化。这种多态性可以有两个或两个以上的等位片断。516RFLP分析法限制酶酶切图谱直接分析法RFLP间接分析法517

（1）限制酶酶切图谱直接分析法①限制酶酶切—Southern印迹杂交。②PCR—限制酶酶切518应用RFLP诊断镰刀状红细胞性贫血正常人珠蛋白基因GAGHbS的珠蛋白mRNAGlu正常人珠蛋白肽链GUGHbS的珠蛋白肽链ValHbS的珠蛋白基因6CA

C正常人珠蛋白mRNA6CTC519MstⅡ酶切位点CCTNAGGCCTNTGGMstⅡ酶AT替换520HbA---------CCTGAGGAG-------HbS---------CCTGTGGAG-------MstⅡM

stⅡMstⅡ1.1kb0.2kb1.3kb5211.1kb1.3kb0.2kbSSASFAARFLP法检测HbSSS:HbS纯合子AS:HbS杂合子AA:正常F:被检胎儿(放射性自显影图谱)522（2）RFLP

间接分析法——RFLP连锁分析法甲型血友病疾病种类：X染色体连锁性遗传病缺陷基因：凝血因子Ⅷ基因主要临床表现：出血性疾病523应用PCR-RFLP连锁分析法诊断甲型血友病用一对引物扩增凝血因子Ⅷ基因第18外显子内的一个1

42bp片断，该片断含一个BclⅠ多态性位点。酶解后，如果存在BclⅠ酶切位点，则产生99bp和43bp两个片断；如果不存在则只有142bp一个片断。研究证明，142bp片断与甲型血友病基因连锁。524142bp99

bp正常男性女性携带者先证者胎儿绒毛样品5252、DNA重复序列多态性分析526（三）基因表达异常的诊断1、mRNA的定量分析（1）相对定量斑点杂交RT-PCR（2）绝对定量2、mRNA长度分析Northern印迹杂交RT-PCR52

7（四）外源DNA检测528第二节遗传病的基因诊断529一、遗传性疾病基因诊断的策略1、直接诊断策略2、间接诊断策略530二、血红蛋白病的基因诊断（一）异常血红蛋白病的基因诊断1、DNA检测与分析（1）PCR-限制酶谱分析法（2）South

ern印迹杂交分析法2、RNA检测与分析RT-PCR531（二）-地贫的基因诊断1、DNA检测与分析（1）RFLP（2）PCR2、RNA检测与分析RT-PCR532（三）-地贫的基因诊断1、DNA检测与分析

（1）PCR-ASO探针法（2）PCR-RFLP连锁分析法（3）DNA芯片技术2、RNA检测与分析RT-PCR533三、杜氏肌营养不良的基因诊断杜氏肌营养不良（Duchenemusculardystrophy,DMD）疾病种类：性连锁隐性遗传病缺陷基因：抗肌萎缩蛋白基因主

要临床表现：横纹肌萎缩、腓肠肌假性肥大。5341、DNA检测与分析（1）RFLP连锁分析法（2）基因组DNA探针法（3）cDNA探针法（4）多重PCR法2、RNA分析与检测RT-PCR535第三节感染性疾病的基

因诊断536第四节肿瘤的基因诊断537一、肿瘤基因诊断的策略1、检测肿瘤相关基因2、检测肿相关病毒的基因3、检测肿瘤标志物基因或mRNA538二、肿瘤相关基因的检测（一）ras癌基因的检测1、常见突变类型：点

突变2、常用检测方法（1）PCR-ASO（2）PCR-SSCP539（二）抑癌基因p53的检测1、常见突变类型：点突变，有少量插入或缺失2、常检测方法（1）PCR-SSCP（2）PCR结合序列分析（3）PCR-RFL

P540（三）其他基因的检测541第五节基因诊断在法医学中的应用542第十七章基因治疗Genetherapy543第一节概述544一、基因治疗的概念基因治疗是指通过在特定靶细胞中表达该细胞本来不表达的基因，或采用特定方式关闭、抑制异常表达基因，达到治疗疾病

目的的治疗方法。545二、基因治疗研究的主要内容或策略（一）基因标记1、用基因标记验证两个问题（1）外源基因能否安全地转移到患者体内；（2）从患者体内取出的细胞能否检测到转移基因的存在。2、常用标志基因：neu基因546（二）基因置换或基因矫正1、概念指将特定的目的基因导

入特定的细胞，通过定位重组，以导入基因置换基因组内的原有缺陷基因。5472、基因置换的必要条件（1）对导入的基因及其产物有详尽的了解；（2）外来基因能有效的导入靶细胞；（3）导入基因能在靶细胞中长期稳定驻留；（4）导入基因能有适度表达；

（5）基因导入方法和所用载体对靶细胞安全无害。548（三）基因添加1、概念通过导入外源基因是靶细胞表达其本身不表达的基因。2、基因添加的两种类型（1）针对特定的缺陷基因导入其相应正常基因（2）向靶细胞中导入靶细胞中本来不表达的基因。3、必要条件：同上。549（四）基因干预采取

特定的方式抑制某个基因的表达，或通过破坏某个基因使之不表达。550第二节基因转移技术和靶细胞551基因治疗的方式体内直接转移基因法（体内法）靶细胞介导的基因治疗（回体法）552一、基因转移的生物学方法（一）逆转录病毒载体1、逆转录病毒载体的结构ψLTRLT

Rgagpolenv553在包装细胞中包装成假病毒LTRLTRneuψAmproriE5542、包装细胞3、逆转录病毒载体的特点（1）结构和感染过程与普通逆转录病毒相似；（2）可使靶细胞变成稳定表达目的基因的转化细胞；（3）感染靶细胞后不扩散；（4

）假病毒感染靶细胞的效率非常高；（5）不感染非增殖细胞。5554、安全性问题（1）感染的可能性（2）污染的可能性（3）在靶细胞基因组中的整合556（二）腺病毒载体1、结构E1AE1BE2BE2AE4E3L1~L55572、特点（1）宿主范围广（2）腺病毒蛋白表达不以宿主增殖为必要条件（3）

可获得高病毒效价（4）重组体非常稳定（5）不会引起肿瘤（6）有较高的安全性（7）无包膜，不易被补体灭活，可直接在体内应用（8）不整合入染色体558（三）腺相关病毒载体1、结构ITRITRREPCAPψ5592、

特点（1）能够进行位点特异性整合（2）无致病性（3）载体结构简单（4）稳定（5）不引起肿瘤形成560（四）单纯疱疹病毒载体1、结构abU1b`a`c`Usca2、特点（1）滴度高（2）容量大（3）增殖细胞和非增殖细胞均可感染（4）不整

合，但可长期存在并可稳定表达561二、基因转移的非生物学方法（一）脂质体（二）直接注射法（三）受体介导基因转移技术（四）其他方法562三、基因转移的靶细胞1、选择靶细胞应考虑因素（1）组织特异性细胞；（2）易获

得、寿命长（3）离体细胞易受外源遗传物质转化；（4）易成活。5632、常用靶细胞（1）造血细胞（2）皮肤成纤维细胞（3）肝细胞（4）血管内皮细胞（5）淋巴细胞（6）肌肉细胞（7）肿瘤细胞（8）其他细胞564第四节基因治疗的应用研究56

5一、遗传病的基因治疗腺苷脱氨酶缺乏症缺陷基因：腺苷脱氨酶基因主要临床表现：免疫缺陷基因治疗方法：逆转录病毒载体包装细胞骨髓造血干细胞回输体内566二、肿瘤的基因治疗研究策略（一）修正肿瘤相关基因的功能1、恢复

抑癌基因的功能2、纠正癌基因的表达（二）导入特定的基因产生肿瘤特异的药物敏感性（三）肿瘤的免疫基因治疗567复习题一、名词基因工程、基因、质粒、载体、Klenow片段、核酸分子杂交、DNA芯片技术、-地中海贫血、细胞癌基因、抑癌基因、基因诊断、基

因治疗、PCR、基因打靶、转基因动物。二、问题1、限制酶由几种类型？Ⅱ型限制酶的作用特点是什么？5682、原核生物基因组结构与功能的特点是什么？3、常用的克隆载体由几种？4、简述原核生物细胞中目的基因筛选和鉴定的遗传学方法

的基本原理。5、重组DNA技术的定义和基本步骤是什么？6、DNA序列测定的方法有那几种？双脱氧链末端终止法测序原理是什么？5697、简述Southern印迹杂交的基本原理。8、试述PCR技术的基本步骤。9、影响核酸分子杂交的因素有哪些？10、简述基因诊断中常用的分子生

物学技术？11、何谓抑癌基因？简述抑癌基因失活与肿瘤发生的关系。12、DNA一级结构突变的诱变剂有哪些57013、DNA芯片的支持物分几类？14、基因打靶的必要条件是什么？571个人观点供参考，欢迎讨论！