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分子诊断学南方医科大学教学目的与要求➢了解遗传性疾病分子诊断的方法学评价及产前（包括胚胎植入前）遗传缺陷分子诊断的适应症。➢熟悉遗传性疾病的分子机制及分子诊断的标准化。➢掌握遗传性疾病及产前（包括胚胎植入前）遗传缺陷的经典检测方法及临床意义。➢重点遗传性疾病及产前（包括胚胎

植入前）遗传缺陷的经典检测方法及临床意义。➢难点遗传性疾病的分子机制。分子诊断学南方医科大学本章目录◼第一节遗传性疾病分子诊断的策略***◼第二节遗传病的分子诊断◼第三节产前（包括胚胎植入前）遗传缺陷的分子

诊断****分子诊断学南方医科大学第一节遗传性疾病分子诊断的策略*◼一、直接诊断策略◼二、基因多态性连锁分析◼三、基因突变的定量（dosage）诊断分子诊断学南方医科大学一、直接诊断策略定义：直接检测导致遗传性疾病的各种基

因突变类型：点突变缺失插入倍增前提：基因已经克隆，序列和结构清楚分子诊断学南方医科大学(一)点突变的诊断1、基因背景清楚的点突变◼等位基因特异性寡核苷酸杂交(allelespecificoligonucleotide,ASO)◼PCR-ELISA

◼等位基因特异性扩增(allelespecificamplification,ASA◼PCR-RFLP◼测序◼基因芯片技术等进行诊断分子诊断学南方医科大学2、基因背景未知的点突变◼单链构象多态性(singl

e-strandconformationalpolymorphism,SSCP)◼变性梯度凝胶电泳(denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)◼异源双链分析(heterodup

lexanalysis,HA)◼DNA序列测定◼蛋白截短测试（proteintruncationtest,PTT）分子诊断学南方医科大学(二)片段性突变的检测（1）少数核苷酸缺失或插入检测点突变的方法（2）大的片段突变Southern印迹技术、多重PCR技术。片段

性突变是指DNA分子较大范围发生突变，碱基的缺失、插入、扩增和重组。分子诊断学南方医科大学二、基因多态性连锁分析检测原理：多态性连锁分析、关联分析检测前提：致病基因尚未被定位和阐明基因太大突变种类太多检测方法：RFLP，VNTR，STR，SNP分子诊断学南方医

科大学三、基因突变的定量诊断检测方法：细胞分裂中期染色体检测固相杂交PCR扩增检测内容：大范围的重复、缺失分子诊断学南方医科大学方法分辨率(碱基数)说明细胞分裂中期染色体检测染色体常规细胞培养至细胞分裂期染色；CGH5x106细胞分

裂中期染色体作为探针来检测和控制不同的杂交；FISH5x104用修饰（如纤维探针）来增强分辨率；阵列CGH5x104使用阵列化的细菌人工染色体载体（Bacterialartificialchromosomes，BACs）而非细胞分裂中期染色体作为探针；M

APH不确定将探针与基因组DNA杂交，然后再扩增探针；微卫星PCR1x102取决于缺失区已知的微卫星；差异PCR1x102要求精心控制起始DNA的质和量，结果为相对量，是一种半定量方法；竞争PCR1x102准确，

结果为摩尔数，是一种绝对定量方法；Real-timePCR1x102成本较高，可有多种方法如Taqman法或分子信标法的SYBRGreen染料或探针，应用越来越广泛；长片段PCR1x102检测基因内缺失比重复更有效，可以确

定突变的性质。分子诊断学南方医科大学第二节遗传病的分子诊断◼一、血红蛋白病◼二、血友病◼三、肌营养不良症◼四、苯丙酮尿症◼五、囊性纤维化◼六、亨廷顿病◼七、脆性X综合征分子诊断学南方医科大学一、血红蛋白病血红蛋白具有4个亚基组成的四级结构，每个亚基可结合1个血红素并携带1分子氧。Hb亚基

之间通过8对盐键，使4个亚基紧密结合而形成亲水的球状蛋白。分子诊断学南方医科大学珠蛋白基因簇16p13.33-p13.11分子诊断学南方医科大学11ｐ15.5珠蛋白基因簇:分子诊断学南方医科大学血红蛋白的类型成

人Hb：HbA2297～98%HbA2222～3%胎儿Hb：HbF22α2Gγ2α2Aγ2胚胎Hb：HbGowerⅠ22ζ2Gγ2ζ2Aγ2(妊娠12周内)HbGowerⅡ22HbPortland22分子诊断学南方医科大学

血红蛋白类型分子诊断学南方医科大学血红蛋白病hemoglobinopathy◼结构异常血红蛋白病镰刀状细胞贫血；不稳定血红蛋白病血红蛋白M病氧亲和力改变◼地中海贫血，珠蛋白的合成降低或消失分子诊断学南

方医科大学1、镰刀形红细胞贫血正常细胞镰刀形细胞◼镰刀状贫血病—血液中大量出现镰刀红细胞，其携带氧的功能只有正常红细胞的一半，患者常因此缺氧窒息。分子诊断学南方医科大学N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu·

····C(146)HbSβ肽链HbAβ肽链N-val·his·leu·thr·pro·val·glu·····C(146)镰刀状细胞贫血分子机制GTGCATCTGACTCCTGAGGAGGTGCATCTGACTCCTGTGGAG分子诊断学南方医科大学分子诊断方法

限制性内切酶法（RE）ASOARMS、跨越断裂点的PCR(裂口PCR、gap-PCR)分子诊断学南方医科大学Sβ肽链Aβ肽链ACTCCTGAGGAGACTCCTGTGGAGRE法(SouthernBlot)MstIICCTNAG

GGGANTCC1.15kb0.2kb1.35kbASSA分子诊断学南方医科大学Sβ肽链Aβ肽链ACTCCTGAGGAGACTCCTGTGGAGRE法(PCR-RFLP)DdeICTNAGGANTC268bpASSA175bp175268443分子诊断

学南方医科大学思考题（作业）◼书中239页中关于HbE检测请回答下列问题◼（1）HbE的突变碱基改变情况◼(2)该突变位于蛋白质的第几个氨基酸◼（3）突变位点位于氨基酸哪一个外显子上◼（4）写出基因组参考序列中此外显子后的内含子序列（5’和3’端各5个碱基）◼(5)用MnlI酶切后，请列

出各种可能的情况◼（6）结合所学习的知识，请再写出几种可能用于诊断的方法。分子诊断学南方医科大学2.地中海贫血◼由于珠蛋白链的合成不平衡所造成的一类常见的单基因遗传性、溶血性疾病。◼类型：◼α地中海贫血，◼β地中海贫血，◼γ地中海贫血，◼δ地中海贫血，以此类推。分子诊断学南方医科大学地中海

贫血分子诊断学南方医科大学α地中海贫血每条16号染色体上有两个αGene——缺失程度不同，α链合成部分或完全受到抑制，导致不同类型的地贫。◼若一条染色体上缺失一个α基因（／α－）为α+地贫，α链合成减少。◼若一条染色体上

两个α基因均缺失（／－－）为α0地贫，α链不能合成。分子诊断学南方医科大学临床类型类型症状正常人静止型+地贫杂合子无症状轻型（标准型）0地贫杂合子轻度贫血+地贫纯合子血红蛋白H病0地贫和+地贫双重杂合子溶血性贫血HbBart’

s胎儿水肿综合征0地贫纯合子胎儿水肿分子诊断学南方医科大学胎儿水肿分子诊断学南方医科大学α地贫的分子基础◼依α基因缺陷程度分为：1Gene缺失型（缺失1～４个α基因）2非Gene缺失型（点突变）：无义突变、移码突变、终止密码

突变、剪接突变等结果1生成无功能或稳定性降低的mRNA无义突变移码突变终止密码突变起始密码突变2RNA加工突变3产生不稳定Hb分子诊断学南方医科大学◼α地中海贫血的分子机制分子诊断学南方医科大学分子诊断方法◼(1)PCR法PCR法已经成为鉴别缺失

型α地中海贫血的首选方法。◼(2)ARMS法该法能快速鉴别诊断HbCS和HbQS◼(3)ASA法与ARMS法相类似◼(4)SSCP法非缺失型α2地中海贫血突变◼(5)等位基因特异性扩增技术(ASPCR）法分子诊断学南方医科大学β地中海贫血β珠蛋白Gene突变或缺失→β珠蛋白链

合成速率下降→溶血性贫血β0地贫：β链完全不能合成β+地贫：β链可部分合成分子诊断学南方医科大学β-地中海贫血临床分类临床类型基因型基因产物临床表现重型地贫+/+、0/00/0、+/0链几乎不能合成链合成相对增加HbF和HbA2增高地中海贫血面

容溶血性贫血（需输血）轻型地贫+/A、0/A0/A能合成适量的链贫血不明显或轻度贫血中间型地贫+/+链部分合成介于重型和轻型之间（不需输血）遗传性胎儿血红蛋白持续增多症缺失或突变链和链合成

受抑制链合成明显增加成人HbF持续增加，无症状分子诊断学南方医科大学患儿颅骨及面颊部骨骼增大，头颅变大，额部隆起，颧高，鼻梁塌陷，两眼距离增宽，眼睑浮肿，形成地中海贫血的特殊面容。分子诊断学南方医科大学X线颅骨照片可见颅骨内外板变薄，板障增宽，在骨皮质间出现垂直短

发样骨刺分子诊断学南方医科大学-地中海贫血的分子基础地中海贫血已发现100多种突变类型，包括点突变和基因缺失。绝大多数地中海贫血是由于基因发生点突变所致，突变涉及基因内及侧翼序列。（1）编码区

突变（2）非编码区突变（3）启动子区突变（4）RNA裂解信号突变（5）加帽位点单个碱基突变分子诊断学南方医科大学☆编码区突变——mRNA稳定性降低或形成无功能mRNA（1）无义突变密码子17：A→C密码子43

：G→Tβ0地贫（2）移码突变密码子71/72：+A密码子41/42：－TCTTβ0地贫（3）起始密码突变ATG→AGGβ0地贫分子诊断学南方医科大学⑴内含子IGT→AT丧失一个剪切信号。⑵新的切点产生同义突变→激活→I和Exon隐蔽裂解位点如：GGT→AGT产生新的剪切

点☆非编码区突变——影响mRNA剪切、加工过程分子诊断学南方医科大学GT→ATGGT→AGT，激活隐蔽剪切位点分子诊断学南方医科大学☆启动子区突变——降低mRNA的转录效率-28位A→G突变破坏了TATABox。分子诊断学南

方医科大学☆RNA裂解信号突变——不能准确裂解和加polyAβ珠蛋白基因3’侧翼序列中AATAAA→AACAAA☆加帽位点单个碱基突变——不能准确裂解和加polyA加帽位点发生A→C颠换，影响转录效率。通常是m

RNA的第一个核苷酸。分子诊断学南方医科大学分子诊断方法◼PCR反向点杂交(PCR-RDB)法◼PCR—RFLP法◼基因芯片法等ND1234658710911分子诊断学南方医科大学二、血友病人体的凝血过程需要多种凝血因子参加。由于凝血因子基因的缺陷而使其中某一凝血因子蛋

白表达降低或缺如即造成血友病(hemophilia)。85％的血友病患者是由于血浆中缺乏凝血第8因子(FⅧ)所致，约10％的患者是由于缺乏凝血第9因子(FⅨ)，前者称为甲型血友病，后者称为乙型血友病。分子诊断学南方医科大学（

一）甲型血友病及其分子诊断◼甲型血友病是由于凝血因子Ⅷ(FⅧ)即抗血友病球蛋白(antihemophilicglobulin,AHG)缺乏所导致的凝血机制异常的遗传性疾病。分子诊断学南方医科大学2．甲型血友病的分子机制在FⅧ基因区域内，有一种A基因存在三个拷贝，其功能不详，其

中一个A基因位于FⅧ基因的第22号内含子内(A1)，另外两个位于X染色体的末端(A2、A3)。A1基因可以与其上游的两个A基因拷贝中的一个发生同源重组，引起FⅧ基因的1-22外显子片段倒位，这种倒位导致FⅧ功能完全丧失

而发生严重的血友病。分子诊断学南方医科大学甲型血友病分子诊断（1）基因倒位的检测由于50％左右的甲型血友病是由于FⅧ基因中的22号内含子倒位引起的，所以检测该突变成为对患者进行基因诊断的首选方法。在检测基因

倒位的方法中首选的是长距离PCR(LD-PCR)技术。分子诊断学南方医科大学(2)非基因倒位的检测点突变是非基因倒位引起甲型血友病的主要原因，因此对该类患者的家系分析和携带者的基因检测主要是通过点突变的检测技术进行。分子诊断学南方医科大学◼1)PCR-RFLP法◼2)VNTR法◼3)STR法◼

4)PCR-SSCP法分子诊断学南方医科大学（二）乙型血友病及其分子诊断◼乙型血友病，又称Christmas病或血浆凝血活酶成分(plasmathromboplastincomponent,PTC)缺乏症，是凝血因子Ⅸ(FⅨ)缺陷所致的一种严重的遗传性出血性疾病。分子诊断学南方医科大学分子机制

◼为编码FⅨ基因缺陷，导致FⅨ含量缺乏或结构异常，从而凝血功能障碍。临床表现与甲型血友病完全相似。分子诊断学南方医科大学分子诊断◼直接测序法、基因芯片法和毛细管电泳(capillaryelectrophoresis,CE)；◼间接检测方法有：RFLP法、SSCP法、DGGE

法、双脱氧指纹图谱(dideoxyfingerprint,ddF)、变性高效液相色谱法(denaturinghighperformanceliquidchromatography,DHPLC）分子诊断

学南方医科大学三、肌营养不良症肌营养不良症又称为假性肥大性肌营养不良。主要有杜氏肌营养不良症(Duchennemusculardystrophy,DMD)和贝氏肌营养不良症(Beckermusculardystrophy,BMD)，它们是

一种常见的X连锁性隐性遗传病，因此患者都为男孩。分子诊断学南方医科大学发病机制主要为抗肌萎缩蛋白基因（dystrophingene)的突变导致肌细胞膜上的抗肌萎缩蛋白(dystrophin)发生结构和功能的改变所致。Dystrophin是抗肌萎缩蛋白基因(DMD基因)的产物，当DMD基因突变

后Dystrophin合成缺乏，该复合物无法有效形成，使细胞膜不稳定，最终造成肌细胞因通透性增加而变性或坏死，导致DMD的发生。分子诊断学南方医科大学2．杜氏和贝氏肌营养不良症的分子诊断(1)多重PCR技术（2）短串联重复序列(shorttandemrepeat,STR)连锁分析（3）

定量PCR技术（4）RT-PCR技术分子诊断学南方医科大学四、苯丙酮尿症◼PKU是由挪威科学家Folling发现的，当时被命名为“苯丙酮尿性智力发育不全”，1937年Penrose和Quastel将之命名为苯丙酮尿

症(phenylketonuria,PKU)。其主要是由于肝内苯丙氨酸羟化酶（phenylalaninehydroxylase,PAH）严重缺失所致的苯丙氨酸代谢异常，为常染色体隐性遗传病。分子诊断学南方医科大学(二)苯

丙酮酸尿症的分子诊断1．PCR－STR连锁分析2．PCR-SSCP法3．PCR-RFLP4．多重ASPCR法分子诊断学南方医科大学五、囊性纤维化(cysticfibrosis,CF)◼CF是由囊性纤维化穿膜传导调节因子(cys

ticfibrosistransmembraneconductanceregulator,CFTR)基因突变所致，为白种人中最常见一种家族常染色体隐性遗传性先天性致死性疾病，多累及儿童和青年，发病率以西、

北欧及北美人群为高。CF常累及胃肠道和呼吸道，极易发生呼吸道感染而引起气道梗阻及呼吸功能不全，多数病人仅能成活数年到十余年。分子诊断学南方医科大学CF分子机制◼CFTR基因突变已达1000余种，已知的CF突

变在CFTR基因中的分布是非随机的，绝大多数集中于编码CFTR蛋白NBFs区的外显子9、10、11、12、19、20、21、22，跨膜区的外显子3、4、7、14a、14b、17b以及R区的第13外显子，其中除ΔF508及另外十余种较为常见的突变外，其余均为罕见突变或仅见于个别

病例。分子诊断学南方医科大学CF分子诊断早期CF的基因诊断基于RFLP连锁分析，采用的探针多为基因克隆过程中获得的基因侧翼DNA片段。在CF基因克隆和测序以后，PCR技术被用于直接基因诊断。同时，新的突变分析方法也相继问世。分子诊断学南方医科大学六、亨廷顿病亨廷顿病（Huntington's

disease,HD)是一种有IT15基因上CAG重复序列一场扩展所致常染色体显性遗传的以舞蹈运动为主要特征神经退行性的疾病。分子诊断学南方医科大学HD分子机制HD即由CAG重复序列的异常扩展突变引起，CAG重复范围在正常

的染色体为9～35个拷贝，而在HD患者的染色体上，重复长度大于拷贝，CAG的拷贝数目与HD的发病年龄负相关，其基因突变率在人类单基因遗传性疾病中最低。分子诊断学南方医科大学HD的分子诊断◼针对不同个体运用三条引物进行PCR扩增，扩增产物变性聚丙烯酰胺凝胶电泳放射自显影鉴定IT15基因（CA

G)ｎ串联重复序列拷贝数，此法能对超过95％HD患者诊断和排除诊断。分子诊断学南方医科大学七脆性X综合征脆性X综合征（fragileXsyndrome,FraX）是仅次于Down’s综合征的又一常见遗传性智力缺陷疾病。分子诊断学南方医科

大学脆性X综合症分子机制1．FMR-1基因5′端(CGG)n重复序列异常2．FMR-1基因5′端CpG岛的异常甲基化3．FMR-1基因缺失4．FMR-1基因点突变分子诊断学南方医科大学脆性X综合征的分子诊断1．Southern印迹杂交法2．PCR法3．微卫星序列分析法分子诊断学南方医科大

学第三节产前（包括胚胎植入前）遗传缺陷的分子诊断◼产前诊断（prenataldiagnosis,PND）*就是在胎儿出生以前，通过对某些特异基因进行分析，以判断胎儿是否有某种遗传性疾病的手段。◼植入前遗传学诊断（preimplantationgeneticdiagnosis,PG

D）*主要是指在显微操作下从体外受精（invitrofertilization,IVF）发育至6～8个细胞期的胚胎中，活检1～2个卵裂球细胞或直接获取受精前后的极体，通过PCR或FISH，进行快速遗传学诊断，选择正常胚胎植入宫内，从而获得健康胎儿。分子诊断学南方医科大学IVF过程分子诊断

学南方医科大学分子诊断学南方医科大学产前遗传缺陷的分子诊断内容◼一、染色体异常分子诊断◼二、单基因病的产前（植入前）分子诊断分子诊断学南方医科大学一、染色体异常分子诊断1．荧光原位杂交2．比较基因组杂交

3．间期染色体转化分子诊断学南方医科大学二、单基因病的产前（植入前）分子诊断1．PND和PGD可诊断的单基因病2．PND和PGD诊断单基因病的分子诊断技术（1）巢式PCR（2）全基因组扩增（WGA）（3）多重PCR（4）荧光PC

R（5）突变分析法分子诊断学南方医科大学PND与PGD的适应证◼可能孕严重遗传病、先天畸形胎儿的孕妇◼有家族史◼夫妇一方有染色体异常◼服致畸药史、病毒感染史◼原因不明的多次流产、死胎等◼胎儿发育迟缓◼孕妇年龄超过35岁