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PCR技术原理及PCR仪的应用§1PCR技术原理§2PCR仪的技术应用第一节PCR技术原理一、PCR技术简史1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并

不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链式反应

（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-

Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪一、PCR技术简史KaryB.Mullis<<TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction>>1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻19

89年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。二、PCR的基本原理•DNA的复制•又称为聚合酶链式反应ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长变成两条

单链DNA二、PCR的基本原理•DNA的复制•聚合酶链式反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCGAUCGCG引物酶引物酶RNA引物RNA引物二、PC

R的基本原理•DNA的复制•聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATC

GCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶二、PCR的基本原理类似于DNA的体内复制•DNA的复制•又称为聚合酶链式反应首先待扩增DNA模板加热变性解链将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生

退火使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。降温升温PCRCycle-Step1-DenaturationTemplateDNAbyHe

at(95oC)TargetSequenceTargetSequencePCR原理示意图①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；PCRCycle-Step2–Temperatur

eislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequences②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的碱基序列配对结合；PCRCycle-Step3-At72oCTaqDNA

polymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporated③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP（各种核苷酸）为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原

理，合成一条新的DNA链。Endofthe1stPCRCycle–Resultsintwocopiesoftargetsequence每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因放大几百万倍。72℃94℃55℃PCR循环No.ofNo.Amplico

nCyclesCopiesofTarget122438416532664201,048,576301,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=

32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon高效的DNA分析技术PCR仪三、普通PCR反应1234522557294时间（min）温度（℃）普通PCR反应•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目

的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍模板DNA95℃PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物PC

R的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束第2轮开始PCR的基本原理PCR

反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点重复30轮后230=

1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2nn循环次数实际拷贝数=(1+x)nX平均效率,约为0.85n循环次数普通PCR反应•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点灵敏度高1.皮克(pg=10-12)量级扩增到微克

(ug=10-6)水平2.能从100万个细胞中检出一个靶细胞3.病毒检测的灵敏度可达3个RFU4.细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速1.一次性加好反应液，2～4小时完成扩增2.扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低◆血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA标准的PC

R反应体系：反应体积：50~100μl10X缓冲液10μL4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA0.1～2μgTaqDNA聚合酶2.5UMg2+1.5mmol/L普通PCR反应（一）普通PCR反应成分（1

）模板单、双链DNA均可（cDNA，逆转录而来，自行得到)。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ngDNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。（2）引物浓度0.1-0.5mol/L浓度过低影响产量，偏高

引起错配和非特异性产物增加，且可增加引物二聚体的产生几率。直接提交模板序列到特定网页。如：http://genome-www2.stanford.edu/cgi-bin/SGD/web-primer;http://frodo.wi.mit.edu/引物设计软件，其中以“Oligo6”和“Pr

emier5.0”最为优秀。首先是引物分析评价功能，其次是引物的自动搜索功能，各种软件在这方面的侧重点不同。（一）引物设计的方法PCR引物的设计（二）一般原则①引物长度在15～30碱基。引物过短，会使特异性降低。

过长会提高相应的退火温度，且合成引物的成本增加。②引物中碱基的分布是随机的，避免4个以上的嘌呤或嘧啶的连续排列，G+C含量宜在45～55％左右。PCR引物的设计③避免两引物间的互补，特别是3‘端互补，以免形成二聚体。④引物自身不应存在连续

超过3bp的互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构或引物本身变性。⑤引物的3’端不能有任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。⑥引物的5’端限定着PCR产物的长度，可根据产物的要求不同，可以选用不同的引物修

饰法。⑦引物与非扩增序列的同源性不应超过70％。（3）TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)0.5-2.5U/50l酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。（1）TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶在75~80℃具有最高的聚合酶活性。75~80℃

每个酶分子每秒可延伸约150个核苷酸，70℃时延伸速度在60nt/s以上。55℃时为22nt/s；37℃和22℃时分别为1.5和0.25nt/s。温度超过80℃时，合成速度明显下降，可能与引物和模板结合稳定性遭到破坏有关。（4）dNTP(

四种核苷酸，提供碱基）20~200μmol/LdNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量，但特异性增加dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活

性。（5）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。10~

50mmol/LTris-Cl缓冲液，72℃时pH7.2,调节反应体系的pH值，使TaqDNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。缓冲液含50mmol/L的KCl可促进引物退火，大于此浓度将会抑制TaqDNA聚合酶的活性。加入适量二甲基亚砜或甲酰胺有利于破坏模板的二级结构。（

6）PCR反应的缓冲液（二）普通PCR的循环参数：（1）变性94oC~95oC，30-60s且最初在加Taq酶之前先于97oC充分变性5~10min（2）退火50oC~55oC，60-90s增加温度能减少引物与模板的非

特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。（3）延伸70oC~74oC，60-120s延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数主要取决于模板DNA的浓度，一般为25-35次次数过多：非特异扩增增加。最后，在72℃保持3-7min，使产物延伸完整，

4℃保存产物。上述参数均在PCR仪上进行设置（三）PCR产物在PCR反应中，DNA扩增过程遵循酶的催化动力学原理。反应初期，目的DNA片段呈指数扩增。随着目的DNA产物逐渐积累，扩增DNA片段的增加减慢进入相对稳定状态，即

出现“停滞效应”，又称“平台期”。到达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、PCR扩增效率、DNA聚合酶种类和活性、以及非特异产物的竞争等因素。到达平台期前，TaqDNA聚合酶一般要进行25次以上PCR循环。多数情

况下，平台期在PCR反应中不可避免。PCR产物的积累规律示意图30个循环最适宜（四）普通PCR的产物的检测琼脂糖凝胶电泳是PCR扩增产物的分离、纯化和鉴定最常用的方法。其分辨率很高，可测出1ngDNA。一般800bp以

上的片段用0.8%的胶，800bp以下的片段用1.0%～2.0%的胶。PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳,凝胶分析成像系统照相扫描并进行密度分析（如图所示）。为了确定PCR产物是否是预先设计的目的片段，或产物是否有突变，都需做分子杂交检测。分子杂交包括点杂交和Southern印

迹杂交。点杂交灵敏度较高，特别适用于特异性不高的PCR扩增产物分析。Southern印迹杂交可鉴定PCR产物的大小和特异性，检测灵敏度可达10ng。基本过程是PCR产物进行常规的琼脂糖凝胶电泳，然后，印迹转移到尼龙膜上，

再用标记的探针进行杂交检测。分子杂交（五）普通PCR反应中应注意的事项（一）防止污染试剂小量分装吸头及Ep管一次性使用器皿及工作区域要分开，无菌操作（二）设立对照：阳性对照：阳性模板阴性对照：阴性模板试剂对照：除模板外的所有组分（六）普通PCR反应中常见问题•无扩增

产物•非特异性扩增•拖尾•假阳性PCRPCR常见问题之二常见问题之二•非特异性扩增现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或出现特异性扩增带与非特异性扩增带。PCRPCR常见问题之三常见问题之三•拖尾

➢现象：产物在凝胶上呈Smear状态。M12（七）普通PCR反应缺点a.只能对终产物进行分析，无法对起始模版准确定量b.必须在扩增反应结束后借助电泳方法分析，费时费事c.无法对扩增反应实时检测d.EB(核酸染料，在电泳时使用）有毒real-time

PCR，FQ-PCR，美国PE（PerkinElmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，该技术是在普通PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的，与普通PCR相比，实时定量PCR具有许多优点。四、实

时荧光定量PCR实时荧光定量PCR：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值（循环数）和标准曲线实现对起始模板进的定量分析。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，探针的5’端标以荧光

发射基团FAM（荧光发射峰值在518nm处），靠近3’端标以荧光淬灭基团TAMRA（荧光发射峰值在582nm处）。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时Taq酶的5’-3’外切酶

活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。（一）实时荧光定量PCR原理和方法荧光发射基团荧光

淬灭基团Taq酶每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，荧光信号与基因拷贝数成正比IQ5Real-timePCR仪循环数，ct值荧光强度随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，得到一条荧光扩增曲线图

实时荧光定量PCR三个关键词：实时，荧光，定量如何实时检测？？？借助荧光物质示踪扩增产物量的变化如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析引入两个概念：荧光阈值、Ct值荧光阈值在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量的标准)阈值线荧光阈

值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在指数扩增阶段任意位置上，默认设置一般是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。但实际应用时要结合扩增效率、线形回归系数等参数来综合考虑Ct值的概念Ct值的定义是PCR扩增过程中，扩增产物(荧光信号）到达阈值时所经过的扩增循环次数C(t)值

C(t)值18.12+/0.04-阈值线浓度低浓度高模板起始浓度越高，Ct值越小CT值与模板起始浓度的关系哪个样品浓度高？普通PCR终点处检测产物量不恒定；Real-timePCR利用Ct的概念，在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该Ct值具有极

好的重复性。定量原理理想的PCR反应：X=X0*2n非理想的PCR反应：X=X0(1+Ex)nn：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率Mg2+Mn2+dCTPdGTPdTTPdATPTaqDNA多聚酶引物

模板DNA或缓冲液荧光物质（二）实时荧光定量PCR反应体系SYBRGreen1染料TaqMan探针荧光化学SYBRGreen1（绿色荧光染料）（三）SYBRGreenI工作原理⚫SYBRGreen1结合到双链DNA的小沟部位⚫在游离状态下，SYBRGreenI发出微弱的荧光，但

一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBRGreenI的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAAE

xtension5’3’5’3’ExtensionContinuedApplyExcitationWavelength5’3’5’3’TaqTaq3’5’3’TaqTaqRepeatBDBDBDBDBDBDBDBDBDBDlllllA制作标准曲线将逆转录得到的cDNA溶液

按101，102，103，104，105进行梯度稀释，以不同稀释度的cDNA为模板扩增目的基因和看家基因，以相对起始浓度和Ct值（循环阈值）为X、Y轴，制作标准曲线。B配制反应体系SYBR®PremixExTaqTM（2×）12.5μlPCRForwardP

rimer（10μM）0.5μlPCRReversePrimer（10μM）0.5μl模板2μldH2O2（灭菌蒸馏水）9.5μl以检测c-fos基因为例：引物：c-fos-forward5'-TGATACACTCC

AAGCGGAGAC-3'c-fos-reverse5'-CCCAGTCTGCTGCATAGAAGG-3'GAPDH-forward5'-CGTGGAAGGACTCATGACCA-3'GAPDH-reverse5'-TCCAGGGGTCTTACTCCTT

G-3‘循环参数：95℃10s预变性，然后94℃40s，60℃40s，72℃40s共60个循环。c-fosreal-timePCR扩增曲线标准曲线融解曲线SYBRGreen1这种非特异性结合dsDNA的染料，

也可能和反应中的引物二聚体非特异性结合，而释放荧光信号，会导致仪器检测的信号不仅仅是目的基因的，所以需要在反应结束后设定一个升温过程，然后慢慢把温度降下来，因为不同DNA片段的解链温度不同，这时若PCR产物纯，则只会出现一个荧光峰，因为只有一个温度值，若有杂质，则会出现其他峰

值，这是一个特异性检测方法。融解曲线参数(dsDNA的解链温度Tm值）：72-95℃,第一步持续时间为45s,接下来每步持续时间为5s。评价产物是否纯在qPCR循环反应结束之后，系统会进行测定融解曲线，通常的方式就是从70度加热到90度，然后每隔一

定时间（1s或者少于1s）测定系统荧光强度，随着温度的升高，dsDNA都解开双链，SYBRGreen都游离之后不发荧光，荧光逐渐下降。那么画出来一个个荧光强度和温度的曲线融解曲线c-fosreal-timePCR随着温度上升，达到图中Tm点时，大部

分扩增出来的双链DNA解开，荧光值下降非常快。如果qPCR产物非常特异那么，融解曲线在80-90之间会形成一个单峰(温度和qPCR产物长度以及GC含量相关）温度dR/dT荧光强度对温度求导●评价产物特异性：使用融解曲线分析（MeltCurveAnalysis）

●评价引物对扩增效率：将模板进行梯度稀释●进行绝对定量：使用扩增曲线和标准曲线⚫使用方便---不必设计复杂的荧光探针⚫没有序列特异性---可以用于不同的模板⚫便宜⚫灵敏（四）SYBRGreenI优点⚫与非特异性产物结合⚫无法实现多个目的基因的检测（五）SYBRGreenI

缺点TaqMan探针荧光素淬灭剂TaqMan（六）TaqMan探针的工作原理TaqMan⚫水解型、具有目标特异性的探针⚫5’为荧光素，3’为淬灭剂5’荧光素3’淬灭剂与目标序列互补5’5’3’3’d.NTPsTherm

alStableDNAPolymerasePrimersAddMasterMixandSampleDenaturation（变性）Annealing（退火）ReactionTubeTaqlRQProbeR

QTaqMan工作原理5’3’RQExtensionStep5’3’1.StrandDisplacementTaq5’3’QTaqR5’2.Cleavage3.PolymerizationComplete5’3’TaqR5’4.Detect

ion5’3’TaqR5’lTaqMan工作原理RQ⚫对目标序列有很高的特异性---特别适合于SNP检测⚫可以实现多通道检测⚫设计相对简单（七）TaqMan探针优点价格较高只适合于一个特定的目标不能进行融解曲线分析背景高（八）TaqMan

探针缺点（九）荧光探针设计遵循原则探针长度应在20～40个碱基左右，保证结合特异性。GC碱基含量在40%～60%，避免单核苷酸序列的重复。避免与引物发生杂交或重叠。探针与模板结合稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度，因此探针的Tm值（DNA熔解

温度）要比引物的Tm值至少高出5℃。另外，探针的浓度、探针与模板序列的同源性，探针与引物的距离都对实验结果有影响。FQ-PCR不仅具有普通PCR的高灵敏性，而且由于荧光探针的应用，可以通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以

获得定量结果，所以还具有DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性，克服了常规PCR的许多缺点。FQ-PCR只须在加样时打开一次盖子，其后的过程完全是闭管操作，不需要PCR后处理，避免了普通PCR操作中的诸多弊端。五、实时荧光定量PCR的特点六、PCR技术应用

•研究–基因克隆，DNA测序，分析突变•诊断–细菌、病毒、寄生虫检测，诊断•人类基因组工程–遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱•法医–犯罪现场标本分析•肿瘤–各种肿瘤检测•其他……1病原体测定由于PCR技术的问世，使

得病原体检测能够快速而方便的进行。但由于其高灵敏性，实验操作很容易受到污染而出现假阳性。只要有微量病原体存在，PCR扩增即可为阳性结果，但并不能作为诊断依据，只有当一定数量的病原体存在时才有临床意义，因

此结模板定量显得特别重要。常规PCR由于不能定量而限制了其应用，然而PE公司研制的FQ-PCR技术给解决这一问题提供了可能。目前该技术已经应用于丙肝病毒、人类乳头瘤病毒、结核杆菌和食品中大肠杆菌等许多病原体的检测研究。Morris等用FQ-PCR对黑猩

猩丙型肝炎动物模型和临床丙型肝炎患者血清中丙肝病毒（HCV）进行了研究。FQ-PCR技术在保持巢式PCR高度敏感性的同时又能提高效率，因此可作为一种检测HCV的有效方法。同时，由于FQ-PCR可以测出血清中病原体浓度，故可给药物治疗及疗效观

察提供参考依据。以前常规检测大肠杆菌的方法，都因为繁琐，需要大量的PCR后处理过程及不能对标本定量而受到限制。美国Witham等1996年将FQ-PCR技术应用于牛肉中大肠杆菌志贺氏毒素基因的检测研究。针对不同血清变异型的大肠杆菌，他

们设计应用不同的探针，从而提高了实验特异性。2.肿瘤研究意大利Gelmini等用FQ-PCR技术检测乳腺癌标本c-erbB-2基因拷贝数目变异情况。他们以β-肌动蛋白基因为参照探索最佳实验条件，当扩增循环数在28～31之间时，△RQ与模板DNA有着较好的剂量依赖关系。他们在此条件下扩增了c

-erbB-2基因和β-球蛋白基因，发现△RQ都与各自的模板DNA浓度存在着线性关系，虽然二者斜率不同，但是各个实验浓度下二者的△RQ之比却是恒定的。说明尽管二者发光效率不同，却不影响定量效果。他们将实验数据与Souther

n印迹结果和已报告的竞争性PCR结果比较都显示高度相关性（n=25，r=0.94，P〈0.01）。3.基因表达研究由于TaqMan系统及荧光探针的应用，对mRNA的检测显得较以前常用的方法如Northern印迹、RT-PCR定量法要方便、快速、准确得多。为了探测骨髓基质血小板生成因子（TPO

）在巨核细胞生成过程中的作用以及血小板生成因子在特发性血小板减少性紫瘢（ITP）、再生障碍性贫血（AA）和特发性血小板多症（ET）等疾病过程中的病理生理意义，日本Hirayama等用TaqManEZRT-PCR试剂盒在ABI7700反应系统测定了正常人和ITP、AA、ET病人的骨髓基质细

胞TPOmRNA水平，又用ELISA方法测定了骨髓和末梢血的TPO浓度。结果显示ITP和AA病人TPOmRNA水平明显升高，而ET病人的TPOmRNA水平则正常，经类固醇治疗后ITP病人TPOmRNA水平下降；骨髓TPO的浓度与其mRNA水平有相关性；在正常人和ITP病人，TPOmRNA

表达水平与巨核细胞计数也有相关性。这个实验对阐明TPO的作用提供了依据。4.免疫组份分析对免疫T细胞群体V-β组份进行分析是研究健康和疾病免疫应答反应的重要手段，可通过流式细胞法或RFQ-PCR法来进行。1997年Lang等用FQ-PCR技

术进行实验，他们在反应系统中引入荧光探针，将下游引物与探针固定，然后，针对不同的V-β成份，选用特异的上游引物进行扩增，再对反应中产生的荧光信号进行处理，即可获得各个成份的数据。5.基因突变及多态性的研究美国Ibrahim等1997年用FQ-PCR技术对正常痘病毒多态性进行了研究。他们

采用一对可与正常痘病毒血凝素基因的某一DNA片段结合的引物，并设计两个有单核苷酸差异的寡核苷酸探针，用荧光标记后进行实验，顺利地把有此单核苷酸差异的两个痘病毒株进行鉴定。该技术也可用于猴痘和病毒DNA疫苗的单核苷酸变异多态的研究。6.其他方面日本Ison

o利用FQ-PCR进行叶绿体成熟度与其基因组拷贝数关系的研究。他们以核基因Cab作为内参照，进行叶绿体基因rbc1拷贝数测定，结果发现子叶出现以后，叶绿体基因拷贝数显著增加，进而把叶绿体的基因拷贝数增加与光诱导的叶绿体成熟过程

联系起来。1998年美国Higgins等还建立起一套用荧光探针检测鼠疫纤溶酶原激活基因（pla）的实验方法。综上所述，FQ-PCR作为一种核酸定量技术，应用较多且较成熟的主要是在病原体检测方面，其优越性在此方面也得以充分体现。因此将该项技术进一步开发应用于临床，具有很大潜力。

但是在遗传病和肿瘤研究方面，尤其是基因表达的研究，该技术目前应用的还较少，在此方面加强研究应用，将会有广阔的前景。