【文档说明】硕士研究生课-现代分子生物学-蛋白质研究进展医学课件.ppt，共(20)页，594.500 KB，由小橙橙上传

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生物系统中目标蛋白分子的分析与鉴定1.生物系统中目标蛋白分子的分析与鉴定三个关键问题:❖目标蛋白分子病理条件下的序列变化（测序）❖避免目标蛋白分子的技术性降解（-70C条件下保存，实验操作通常在冰浴下进行，与此同时要加全蛋白酶抑制剂）❖结合实验目的，选

择合适的分析方法（定性与定量，相对定量与绝对定量）2.生物系统中总蛋白质的定量❑凯式（Kjedahl）定氮法❑光吸收法❑双缩脲法❑福林-酚法❑考马氏亮兰G-250法❑氨基酸分析法❑BCA法3.凯式（Kjedahl）定氮法➢最早的经典方法。➢各种蛋白质的含氮量相对恒定，14％

~16％。➢计算公式：蛋白质量=含氮量/16%=6.25×含氮量。➢实验步骤如下：➢注意事项:本法非常灵敏，务必避免外界氨的干扰。一定量蛋白质硫酸铵溶液氨气蛋白质含氮量蛋白质含量(NH4)3BO3浓硫酸NaOH蒸馏H3BO3HCl,滴定指示剂4.光吸收法➢因为芳香族氨基酸Tr

yptophan和Tyrosine的存在，使得Proteins溶液在280nm呈现特征性吸收峰。以此来定量溶液中的Proteins。➢一个经验公式：当Proteins溶液A280=1时，溶液中Proteins的浓度=1mg/ml。➢各种Protein所含芳香族Amino

acid的含量是不同的，有时会有较大差异，因此光吸收法是一种较粗略的蛋白质定量方法。➢有时Proteins样品中有Nucleicacids存在，Nucleicacids也有紫外吸收，因此会对Proteins的测定产生干扰。这时采取分别测定280nm和260nm光吸收值，并以下式计算。蛋白质

浓度（mg/ml）＝1.45A280－0.74A260。5.光吸收法(continue)➢最准确的办法是，首先得到TargetProtein在280nm的吸光系数，其次针对性地测定该TargetProtein溶液的280nm吸光度值，最后再利用公式计算溶液中TargetProte

in的浓度（C=A280/L,L：比色杯内径cm）。➢测定TargetProtein在280nm的吸光系数，必须首先得到干燥的该TargetProtein纯品。在105ºC下恒重后，精确称量1~10mg，再定量溶于一定体积的蒸馏水中，通常浓度为1mg/ml，测定溶液280

nm光吸收，计算得到吸光系数。6.双缩脲法❑基于蛋白质链肽键“－CO－NH－”有双缩脲反应特性即，Proteins在碱性溶液中与Cu2＋发生络合反应显蓝色。❑受Proteins特异性影响较小。❑适用于较大量Proteins（mg）的

定量测定。❑实验操作简便。7.福林-酚法❑灵敏度和准确度均较高。❑实验操作较繁琐。❑影响因素较多，如去垢剂等。8.考马氏亮兰G-250法❑实验操作简便。❑适合于定量10~100g的Proteins。

❑应用广泛。❑测定Proteins的考马氏亮兰G-250溶液也叫作“home-made”试剂。9.氨基酸分析法❑通过把Proteins水解成Aminoacid，然后再对Aminoacid进行分析来定量Proteins。❑很准确，最接近于真实值。❑测定值比实际量有时

会偏低。主要原因是Protein水解时，Trp被完全破坏，Cys也要遭受很大损失，Ser和Thr的回收也只有90％。一种新的测定蛋白质的方法：BCA法10.BCA法❑一种新的测定Proteins的方法❑灵敏度和重复性均佳。❑干扰因素少。❑试剂公司（Pierce）有

试剂盒供应。11.生物系统中某种TargetProtein的定量❑ELISA（EnzymeLinkedImmunoSorbentArray）❑Westernblotting❑Enzymeactivity测定12.夹心法（sandwichmethod）AntigenAntibody-1Ant

ibody-2ELISA（EnzymeLinkedImmunoSorbentArray）13.讨论题一：➢某实验室欲建立一种双抗体夹心法，以检测人血清中蛋白A的含量。以往该实验室曾自己制备了一兔抗人蛋白A多克隆抗体，并从某公司购买了一鼠抗人蛋白A单克隆抗体。该实验室按如下方案进行预实验，结果失败

了。请分析最可能的原因是……。Antigen，人蛋白APolyclonalantibodymonoclonalAntibody14.讨论题二：➢上述实验室不甘心失败，仔细分析后找到了失败的原因。为了达到实验目的，他们调整实验方案如下，进行预实验，结果又失败了。请分析最可

能的原因是……。Antigen，人蛋白APolyclonalantibodyMonoclonalAntibody15.讨论题三：➢……………………………………………..。…………讨论题X：➢……………………………………………..。16.MMP-9MMP-2M1234kD21217011

67653600﹣500﹣400﹣300﹣200﹣100﹣542.625.01234300﹣250﹣200﹣150﹣100﹣50﹣251.43.80.0100.0MMP-9相对密度单位1234100.00.0MMP-2相对密度单位M.蛋白marker1.培养液空白对照，2.食管

癌细胞SHEEC对照3.有义促进NGAL基因表达的食管癌细胞SHHEC4.反义封闭NGAL基因表达的食管癌细胞SHHEC细胞培养上清液中MMP-9和MMP-2活性的检测结果17.TargetProtein的鉴定❑Prot

ein测序：1）N-end测序，2）C-end测序，3）质谱测序。❑pI测定❑HPLC分析。❑SDS-PAGE电泳分析。❑CE分析。❑肽谱分析（Fingerprinting）。❑MALDI-TOF-MS。18.TargetProtein的鉴定❑巯基的鉴定。❑糖基修饰的鉴定。❑磷酸基修饰的鉴定。

❑甲基修饰的鉴定。❑酰基修饰的鉴定。❑酰胺基的鉴定。❑X-ray衍射分析TargetProtein晶体结构。19.•谢谢！20