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第四章体外放射分析核医学教研室教学目的◼掌握体外放射分析的原理（RIA、IRMA）◼掌握RIA与IRMA的异同◼掌握RIA、IRMA的基本操作程序◼掌握RIA、IRMA的基本试剂◼了解体外放射分析试剂的要求◼体外放射分析B与F的常见分离方法重难点◼重点：1、

RIA、IRMA的原理2、RIA、IRMA的异同点◼难点：1、RIA的原理体外放射分析指在体外实验条件下，以特异结合反应为基础，以放射性测量为手段，对生物活性物质进行超微量分析的总称。特点：灵敏度高、特异性强、精密度好、应用范围广、方法简便。按反应机制分竞争性

放射分析Competitiveradioassay非竞争性放射分析Non-Copetitiveradioassay一体外放射分析的概述（一）特异性结合1、抗原与抗体2、配体与受体3、底物与酶4、激素与血浆结合球蛋白（二）结合反应动力学规律[L]+[B]=[LB]1、竞争性结合分析[L]+

[*L]+[B]=[LB]+[*LB]2、非竞争性结合分析Sp.Ab1+Ag=SpAb1.Ag+*Ab2=Sp.Ab1.Ag.*Ab2+*Ab2（三）放射性测量放射性测量是定量的基础第一节放射免疫分析

radioinnumoassay,RIA竞争放射分析◼放射免疫分析（RadioImmunoAssay,RIA）◼竞争性蛋白结合分析（CompetitiveProteinBindingAssay,CPBA）◼放射受

体分析（RadioReceptorAssay,RRA）[L]+[*L]+[B]=[LB]+[*LB]（一）放射免疫分析原理*Ag+Ag+Ab=(*Ag—Ab)+(Ag—Ab)+*Ag+Ag0MaxMin条件：1、*Ag定量、足量2、Ab限量*Ag>Ab放射性计数[Ag

]Ag与*Ag-Ab成反比！专用符号：1、T(Total):加入的*Ag的放射性计数2、B(Bound):*Ag—Ab免疫复合物的放射性计数3、B0Ag=0时*Ag—Ab放射性计数4、F(Free):游离的*Ag的放射性计数T=B+F5、N

SB(Non-specificbinding):非特异性结合产生的放射性计数6、结合率：B/T、B/B0、B/F*Ag+Ag+Ab=(*Ag—Ab)+(Ag—Ab)+*Ag+Ag不同坐标体系对应RIA

剂量反应曲线（二）RIA的三种基本试剂◼标准品（Ag）◼标记物（*Ag）◼抗体（Ab）放射性免疫及免疫放射分析试剂盒1、标准品◼化学结构：应与被测物具有相同的化学结构◼化学纯度：纯品◼化学度量：准确◼稳定性：保持生物活性

不变2、标记物◼要求：1、较高的比活度2、生物活性与免疫活性：与标记前一致3、放射化学纯度：>95%4、稳定性◼鉴定：1、最大结合率2、标准曲线比较法3、稀释曲线比较法3、抗体◼要求：1、亲和力2、高滴度3、特异性4、可长期保

存抗体◼抗原◼动物选择◼佐剂◼免疫动物、收获鉴定抗体一、多克隆抗血清抗血清的鉴定◼亲和力：指抗体与抗原的结合能力，常用平衡亲和常数KA表示。◼特异性：抗体与相应抗原的结合能力与其它类似物结合能力的比较，常用交叉反应率（CrossReaction）表示交叉反应率=Y/Z×100%Y：

标准抗原取代50%结合率所对应的浓度Z：类似物取代50%结合率所对应的浓度◼滴度：结合50%标记抗原时血清的稀释度单克隆抗体◼特点：特异性高抗体成分专一可反复制备◼制备：1、免疫小鼠，制备脾细胞悬液2、选择培养，用HAT培养基筛选杂交瘤细胞3、检测抗体4、克隆化（三）分离方法1、分离方

法的要求1、使结合部分与游离部分尽可能完全分开2、分得的成分便于作放射性操作3、分离效果不受外界干扰因素影响4、操作简便、分离迅速、重复性好5、试剂来源广泛、价廉易得2、常用的分离方法聚乙二醇法（PEG）活性炭吸附法盐析法微孔滤膜法双抗体法SPA法固相抗体法

：塑料、纤维素、凝胶颗粒、多孔玻璃微球磁化颗粒法非特异性分离方法特异性分离方法（四）放射免疫分析方法的建立1、反应方式◼平衡法◼顺序加样法◼STAT法2、加样程序◼实验设计◼配制试剂◼加未标记物（标准品或待测样品）◼加标记物（*Ag）◼加抗体（Ab

）◼混匀、温育◼加分离剂、分离B与F◼测量各管放射性计数，绘制标准曲线◼由标准曲线反求出样品浓度第二节、免疫放射分析（ImmunoradiometricAssay,IRMA）一、IRMA的原理及方法学◼单位点系统

◼双位点系统◼标记第三抗体法◼双标记抗体法1、单位点系统：[Ag]放射性计数Ag与Ag-*Ab成正比！2、双位点系统用抗原的二株单克隆抗体，一株制备固相抗体（●·Ab1）与标准品或待测样品中的抗原（Ag）结合反应，加入另一株制备标记的抗体（*Ab2），最终结合形成固相抗体—

抗原—标记抗体（Im-Ab·Ag·*Ab）复合物，剩余的标记抗体（*Ab）呈游离液态被分离。●·Ab1+Ag●·Ab1.Ag+*Ab2●·Ab1·Ag·*Ab2+*Ab2Ag与Ag-*Ab成正比！[Ag]放

射性计数3、标记第三抗体及生物素-亲和素系统二、IRMA的特点1、示踪剂：标记抗体2、反应动力学：无竞争，反应速度更快3、灵敏度：更高4、特异性：二株单抗，交叉反应率更小5、标准曲线工作范围：更大，但应

注意“倒钩效应”6、方法稳定性好：加样误差仅来自抗原7、不足：目前仅能检测大抗原三、RIA与IRMA的异同1、二者相同点：1、均为免疫结合反应；2、均检测抗原；3、反映的是抗原的免疫活性；4、以放射性测量为手段。2、二者主要区

别RIAIRMA1、竞争性结合分析非竞争性结合分析2、三种主要试剂二种主要试剂3、*Ag-Ab与Ag成反比Ag-*Ab与Ag成正比4、标记抗原标记抗体5、反应达到平衡慢反应达到平衡快6、NSB主要影响高剂量反应NSB主要影响低剂量反应非放射性标记免疫分析技术◼酶标记免

疫分析法◼化学发光法◼时间分辨免疫荧光分析法◼基因芯片技术思考题1、名词解释：体外放射分析、RIA、IRMA、T、F、B、B0、NSB、2、简述RIA、IRMA的原理。3、简述RIA、IRMA的异同点。4、简述常用的体外放射分析B

与F的分离方法