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以下为本文档部分文字说明：

感受态和提取质粒精美生物医学3、Ca2+处理细胞的原理1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时呈现感受态4、感受态细胞的制备步骤①挑单个菌落接种到20mlLB培养基中，3

7℃剧烈振荡过夜。②取1ml过夜培养物,接种到25mlLB培养基中,37℃振荡培养1-2小时，直至培养夜中细菌浓度达到OD600为0.2-0.4(细菌对数期生长)。或取1ml甘油菌，接种到100mlLB培养基中，37℃振荡培养1-2小时。(共接两瓶)③培养物冰上放置10min，4000r

pm,4℃离心10分钟，收集菌体。④将菌体悬浮于5ml预冷的CaCl2中,冰上放置20分钟。⑤4000rpm,4℃,离心10分钟，弃上清，然后将细菌轻轻悬浮在2mlCaCl2中，0-4℃保存24至48小时。⑥或缓慢滴入甘油(灭菌)至浓度为15％,轻柔混匀，将细菌分装

成0.2ml/每管，干冰上放置1小时，转入-80℃冰箱储存。制备感受态细胞的注意事项1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）；2．所有操作均应在无菌条件和冰上进

行；3．一定时间内使用经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总活菌数随时间延长而减少造成的）4．所使用的器皿必须干净。痕量的去污剂或其它化

学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率J-30I高速冷冻离心机用途1.细菌、蛋白沉淀；核酸提取；细胞/亚细胞组份分离。2.动、植物病毒分离、血液血清提取及溶液中大、小颗粒不同组份的分离。、操作步骤1打开离心机盖,选择容量适合的转子，将带样品离

心管放入转子内（样品一定要平衡好）。2关好离心机盖，设定离心机转子型号、转速、离心时间、温度、启动运转。3离心时间到待转速降至零，打开离心机盖将样品（离心管）取出，用柔软干净的布擦净转头和机腔内壁，待离心机腔内温度与室温平衡后方可盖上机盖。注意事项▪机体应始终处于水平位置，外接电源系统的电

压要匹配，并要求有良好的接地线。▪开机前应检查转头按装是否牢固，机腔有无异物掉入。▪样品应预先平衡。▪离心机运行时，离心机周围30cm范围内不能有人和危险物品。▪挥发性或腐蚀性液体离心时，应使用带盖的离心管，并确保液体不外漏以免腐蚀机腔或造成事故。注意事项▪易燃易爆以

及易与其他物质发生反应的物质不能离心。▪在没有相应的防护措施时，不能离心有毒的、放射性的物质或病原微生物。▪离心机运行时不可人为地打开盖子。▪如果转头和盖子有可见的腐蚀或磨损的痕迹，则应立即停止使用。▪使用的玻璃或塑料离心管应能承受相应的离心力并大小合适。非金属转头不可用紫外照射

。▪如果被离心的物品密度大于说明书的规定范围，应根据RCF计算公式，减小离心体积。维护和保养▪转头应定期清洗和消毒。擦拭离心机腔时动作要轻，以免损坏机腔内温度感应器。▪使用消毒液处理时，温度不可超过25℃，时间不可超过规定时间。▪可以用高压消毒的转头，应在清洗后

，121℃消毒20分钟，转头务必平放，并不受挤压，以免变形。▪每次操作完毕；应作好使用情况记录，并定期对机器各项性能进行检修。▪离心过程中若发现异常现象，应立即关闭电源，报请有关技术人员检修。二、提取质粒1、提纯的思路：▪质粒的特性：共价、闭合、环

状的小分子量DNA▪要去除的物质：蛋白基因组DNA脂类及小分子杂质RNA2、原理▪碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们▪在碱性时，DNA变性，恢复中性时，线性染色体DNA不能准确复性，与

其它大分子共沉淀，而质粒DNA却可以准确复性，留在上清中。3、实验材料、器具及药品❖实验器具微量取液器(20μl,200μl,1000μl)，台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，涡旋振荡器。❖实验材料E.coliDH5α菌株，1.5ml塑料离心管(又称eppendorf管)

,离心管架。❖实验药品1.LB培养基配制及分装(每升用量)胰蛋白胨(Bacto-tryptone)10g酵母提取物(Bacto-yeastextract)5gNaCl10gpH7.5121℃，20min高压灭菌2.

溶液溶液Ⅰ200ml50mmol/L葡萄糖1.98g25mmol/LTris-Cl(pH8.0)5ml1M10mmol/LEDTA(pH8.0)5ml0.4MTris-Cl溶液：控制好溶液的pH葡萄糖:使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子底部EDTA:是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，

可以抑制DNase的活性和微生物生长使用溶液Ⅰ要点：菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率。▪溶液Ⅱ▪0.4mol/LNaOH▪2%SDS▪临用前1:1混合贮存液即为II液.▪NaOH：最佳的溶解细胞的试剂，

不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱后几乎在瞬间就会溶解。▪SDS：呈碱性，但如果只用SDS，达不到彻底溶解细胞的作用，加入SDS主要为下一步做铺垫。▪SDS在高盐浓度下发生沉淀，同时与蛋白质结合，所以沉淀也将溶液中的大部分蛋白质沉淀下来。▪使用

溶液Ⅱ要点：时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。▪溶液Ⅲ▪5mol/L醋酸钾60ml▪冰醋酸11.5ml▪水28.5ml(最终pH4.8)▪溶液中的K+：置换了SDS中的Na+而形成了不溶性的PDS，高浓度的盐使沉淀更完全。▪2M

的醋酸：中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA。所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，否则最后得到的质粒上会有大量的基因组DNA污染。▪使用溶液Ⅲ要点：混合均匀后在冰上放置，可以使PDS沉淀更充分。3.分离液酚/氯仿/异戊醇＝25:24:1酚：使蛋

白质变性，作用大于氯仿。氯仿：增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收，跑到水相中的酚会少得多。异戊醇：主要可以使离心后上下层的界面更加清晰，方便水相的回收。▪4.无水乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀▪5.70%乙醇▪6.无菌水▪7、TE缓冲液：溶

解DNA4、实验步骤接含PUC18(或pET21a)质粒的单菌落于3mlLBAmp+液体培养基中370C，190rpm振荡培养过夜取1.5菌液入1.5ml的dorf管中6000rpm、离心2min，弃上清，收集菌体100uL溶液I悬浮菌体（充分振荡），室温（或

冰浴）10min加入200uL溶液II（轻轻混匀），冰上静置5min裂解菌体加入150uL溶液III（轻轻混匀），冰上静置15min质粒DNA复性12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管

上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（振荡混匀）12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管（可省略）上清加等体积的氯仿：异戊醇（振荡混匀）12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一

新管上清加2倍体积的无水乙醇（充分混匀），冰浴30min12000rpm，离心15min沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次（振荡混匀、离心）12000rpm，离心10min沉淀超净台中风干沉淀用20uLRTE溶解，-200C保存质粒的检测——凝胶

电泳▪琼脂糖凝胶电泳▪聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）谢谢你的阅读❖知识就是财富❖丰富你的人生71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗73、坚持意志伟大

的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原75、内外相应，言行相称。——韩非