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分析方法验证2015.04.271◼药品的生产过程中，原料、中间品、成品均需进行检验，检验结果既是过程受控的依据，也是评价产品质量的重要依据，检验结果应具有准确可靠。而分析方法的验证为检验结果的准确及可靠提供

了有力保障。◼分析方法验证系指确保某项分析方法得出的结果可以持续地准确反映所测产品特性的书面证明。◼通常分析方法的验证可分为药典或注册分析方法的确认和非药典或注册分析方法的验证。2主要内容➢法规要求➢验证要求➢验证内容➢方

法确认➢方法再验证➢参考资料3法规要求◼中国GMP(2010)、中国药典非常关注验证的过程,分析方法验证不完善是常见的问题。◼–药品质量标准中分析方法必须验证◼–药物生产工艺变更、制剂的组分变更、原分析方法进行修订时，则质

量标准分析方法必须进行验证。4法规要求◼•EUGMPVolume4◼–Analyticalmethodshallbevalidated,alltestingoperations◼describedinthemarketingauthorisationshouldbecarriedout◼a

ccordingtotheapprovedmethod.5法规要求◼•FDAcGMP[21CFR211.]◼–Testmethod,whichareusedforassessingcomplianceof◼pharmaceuti

calarticleswithestablishedspecifications,mustmeet◼properstandardsofaccuracyandreliability.6法规要求◼第十二条质量控制的基本要求：◼（四）检验方法应当经

过验证或确认；7法规要求◼第二百二十三条物料和不同生产阶段产品的检验应当至少符合以下要求：◼（二）符合下列情形之一的，应当对检验方法进行验证：◼1.采用新的检验方法；◼2.检验方法需变更的；◼3.采用《中华人民共和国药典》及其他法定标准未收载的检验方

法；◼4.法规规定的其他需要验证的检验方法。8法规要求◼（三）对不需要进行验证的检验方法，企业应当对检验方法进行确认，以确保检验数据准确、可靠；9法规要求◼2010版药典中分析方法验证指导原则(附录XIXA)只规定了项目和基本方法而没有合格标准,ICH和USP

类似10法规要求◼ICHQ2(R1)：ValidationofanalyticalProcedures:Text◼andMethodology--2005/11◼ICHQ2A：TextonValidationofAnalyt

icalProcedure◼(ParentGuideline)--1994/10◼ICHQ2B:ValidationofAnalyticalProcedures:◼Methodology(DevelopedtocomplementtheParent◼g

uideline)--1996/1111法规要求◼USP<1225>ValidationofCompendialProcedures◼•EuropeanDirectoratefortheQualityo

fMedicines&◼HealthCare[PA/PH/OMCL(05)47DEF]Validationof◼AnalyticalProcedures–2005/0612法规要求❖药典或官方标准收载的方法❖－不需完整验证❖－需验证方

法的适用性（确认）❖自研方法或对官方标准进行了大幅调整❖－需完整验证13问题一❖新版GMP中规定哪些情况下必须做方法验证？14验证要求目的：证明采用的方法适合于相应的检测要求。15验证要求前提条件：①仪器：仪器已经过验证和校正且在有效期内

；②人员：人员应经过充分培训，熟悉方法及所使用的仪器；③物料：所用的物料，包括标准品、试剂、实验用容器等，均应符合试验要求，不能带入污染、误差。如进行高效液相色谱分析时，所用试剂应为色谱级16验证要求前提条件：④方法：该分析

方法的开发和优化已经成功完成；⑤环境：试验环境符合该分析方法的要求，例如：有些分析方法可能对温湿度敏感。17验证要求原则：原则上每个检测项目采用的分析方法，均需要进行方法验证。方法验证的内容应根据检测项目的要求，结合所采用分析方法的特点确定。。18验证要求原则：同一分析方法用于不同的检测项目会有不

同的验证要求。例如，采用高效液相色谱法用于制剂的鉴别和杂质定量试验应进行不同要求的方法验证，前者重点要求验证专属性，而后者重点要求验证专属性、准确度、定量限等验证项目。19验证要求主要方面：（一）需要验证的检测项目检测项目是为控制药品质量，保证安全有效而设

定的测试项目。根据检测项目的设定目的和验证内容的不同要求，通常将需验证的检测项目分为鉴别、杂质检查（限度试验、定量试验）、定量测定（含量测定、溶出度、释放度等）、其他特定检测项目等四类。20验证要求主要方面：（二）分析方法分析方法是为完成上述各检测项目而设定和建立的

测试方法，一般包括分析方法原理、仪器及仪器参数、试剂、系统适用性试验、供试品溶液制备、对照品溶液制备、测定、计算及测试结果的报告等。21验证要求主要方面：（三）验证内容验证内容通常包括方法的专属性、线性、范围、准确度、精密度、检测限、定量限和耐用性。22问题

2通常需要验证的项目有哪些？23验证内容注：—表示通常不需论证的项目；+表示通常需论证的项目；①假如已论证重现性，可不需再论证中间精密度；②缺乏专属性的分析方法，应由其他分析方法来作补充；③有些情况不需要。2425验证内容-系统适用性◼系统适用性试验是许多分析方法

的组成部分，这些试验的基本概念是要把由分析设备、电子仪器、实验操作和被分析样品所组成的完整系统进行整体评估。对于特定方法的系统适用性参数的建立依赖于被验证方法的类型。◼Ø常见的考察参数有：理论塔板数、分离度、容量因子、拖尾因子、峰纯度等。◼Ø除药典另有规

定外，液相色谱的内部标准为：N≥2000，R≥1.5，T≤1.5；气相色谱的内部标准为：N≥5000，R≥1.5。26验证内容-系统适用性27验证内容-专属性◼指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性，能反映

该方法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力，是指该法用于复杂样品分析时是否受到相互干扰程度的度量。◼通常，鉴别、杂质检查、含量测定方法中均应考察其专属性。如采用的方法不够专属，应采用多个方法予以补充。28验证内容-专属

性◼1、鉴别反应◼鉴别试验应确证被分析物符合其特征。专属性试验要求证明能与可能共存的物质或结构相似化合物区分，需确证含被分析物的供试品呈正反应，而不含被测成分的阴性对照呈负反应，结构相似或组分中的有关化合物也应呈负反应。29验证内容-专属性◼2、

杂质检查◼作为纯度检查，所采用的分析方法应确保可检出被分析物中杂质的含量，如有关物质、重金属、有机溶剂等。因此杂质检查要求分析方法有一定的专属性。◼在杂质可获得的情况下，可向供试品中加入一定量的杂质，证明杂质与共存物质能得到

分离和检出，并具适当的准确度与精密度。验证内容-专属性◼2、杂质检查◼在杂质或降解产物不能获得的情况下，专属性可通过与另一种已证明合理但分离或检测原理不同、或具较强分辨能力的方法进行结果比较来确定。或将供试品用强光照射，高温，高湿，酸、碱水解及氧化的方法进行破坏（制剂应考虑辅料的影◼响

），比较破坏前后检出的杂质个数和量。必要时可采用二极管阵列检测和质谱检测，进行色谱峰纯度检查。30验证内容-专属性◼3、含量测定◼含量测定目的是得到供试品中被分析物的含量或效价的准确结果。◼在杂质可获得的情况下，对于主成分含量测定可在供试品中加入杂质或辅料，考察测定结果是否

受干扰，并与未加杂质和辅料的供试品比较测定结果。◼在杂质或降解产物不能获得的情况下，可采用另一个经验证了的或药典方法进行比较，对比两种方法测定的结果。也可采用破坏性试验（强光照射，高温，高湿，酸、碱水解及氧化），得到含

有杂质或降解产物的试样，用两种方法进行含量测定，比较测定结果。必要时进行色谱峰纯度检查，证明含量测定成份的色谱峰中不包含其他成份。3132验证内容-专属性◼可接受标准◼1.应当证明潜在的干扰成分不会对方法的◼性能

产生负作用。对于层析分离方法，要◼求证实杂质之间﹑杂质与主峰之间的选择◼性；分辨率≥1.5，如果证明确实可行，某◼些情况下分辨率低于1.2也可以接受。◼2.空白对照应无干扰。33验证内容-专属性34验证内容-准确度◼准确度系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度

，一般以回收率%表示。◼准确度为定量测定的必要条件，因此涉及到定量测定的检测项目均需要验证其准确度，如杂质定量检查、含量和溶出方法，分析方法的准确度能够确保：◼①样品中的待测物全部溶解；◼②待测物全部从检测器中检出。◼35验证

内容-准确度◼准确度的测定至少选取包括标准浓度在内的至少3个浓度级别（通常选取80％、100％和120％），每个浓度级别至少测定3次，计算测定结果的回收率。◼36验证内容-准确度◼原料药◼1.可用已知纯度的对照品或符合要求的原料药进行测定；◼2.用本法所得结果与已建立准确度的

另一方法测定的结果进行比较。37验证内容-准确度◼制剂◼1.用含已知量被测物的各组分混合物进行测定；◼2.如不能得到制剂的全部组分，可向制剂中加入已知量的被测物进行测定（加样回收试验◼法）；◼3.用本法所得结果与已建立准确度的另一方法测定的结果进行比较。38验证内容-准确度◼杂质◼1.往样品中

加入已知量的杂质进行测定；◼2.若不可能得到某种杂质或降解产物，可把此方法的分析结果与另一已验证的或药典的分析方法获得的结果进行比较。39验证内容-准确度◼通常采用回收率测定的试验可分为：◼空白回收（制剂空白）◼加样回收（适用于：中药材，复方制剂等）◼空白回收的

计算方法：40验证内容-准确度◼加样回收的计算方法：◼其中：◼M为测定值；◼P为背景值；◼A为已知值（真实值）。41验证内容-准确度◼加样回收的试验方法：◼同一样品，制备三个浓度的供试品，每个浓度分别制备三份供试液，例如：◼取相同量

样品9份（一般为样品取样量的一半），设计三个浓度，按不同比例加入对照品。中间浓度一般按1:1比例加入；低浓度和高浓度可分别选0.5:1和1.5:1的比例，加入对照品的量要适当，保证供试品溶液的浓度（或量）在考察的线性范围内。42验证内容-准确度◼接受标准◼含量和溶出：◼HPLC方法的接受标

准◼各浓度下的平均回收率应在98.0%-102.0%之间，9个回收率数据的相对标准差（RSD）应不大于2.0%。◼中药一般应满足以下规定：回收率计算值在95%-105%范围，相对标准偏差（RSD%）薄层扫描法<5%。43验证内容-准确度◼接受标准◼含量和溶出：◼UV方法的

接受标准◼各浓度下的平均回收率应在98.0%-102.0%之间，9个回收率数据的相对标准差（RSD）应不大于1.0%。◼容量分析方法的接受标准◼各浓度下的平均回收率应在99.7%-100.3%之间，9个回收率数据的相对标准差（RSD）应不大于0.2%。44验证内容-准确度◼

接受标准◼杂质：45验证内容-准确度◼注意问题◼1.活性物质；◼2.容器或过滤器可能会吸附活性物质；◼3.处方中的辅料、色料和制造过程可能会影响准确度。◼4.待分析物质是否完全溶解以及溶液的澄清度。46验证内容-准确度47问题三◼什么是准确度？准确度用什么来表示？48验证内容-精密度◼精密度系指

在规定的条件下，从同一个均匀样品中，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。一般用偏差（d）、标准偏差（SD）、相对标准偏差（RSD）（变异系数CV）表示。◼偏差（d）d=xi-x测量值与平均值之差；◼标准偏差（SD）◼相对

标准偏差（RSD）验证内容-精密度4950验证内容-精密度◼杂质定量检查、含量和溶出方法均应验证其◼精密度，精密度可以用重复性、中间精密度◼和重现性表示。◼1、重复性◼重复性系指在同样的操作条件下，在较短时◼间

间隔内，由同一分析人员测定所得结果的◼接近程度。51验证内容-精密度◼重复性的评价：◼(1)在方法规定的线性范围内至少测定9次(如3◼个浓度级别80％，100％和120％，每个浓度◼级别测定3次)，或◼(2)在100

％的试验浓度，至少测定6次。◼注意：每种测定应从样品称量或者高浓度溶液◼的稀释开始。52验证内容-精密度◼2.中间精密度：系指同一实验室不同日期、◼不同仪器、不同分析人员对同一样品、采用同◼一方法处理样品所得结果之间的接近程度。◼验证方法：同一批样品每位分

析员准备六份进◼行测量，计算两人之间平均值的差异。◼3.重现性：一般实验室不进行此项考察，只◼有当分析方法将被法定标准采用时，才进行重◼现性试验。建立药典分析方法时常需通过协同◼检查得出重现性的结果。53验证内容-精密度◼接受

标准◼1.重复性◼原料药方法验证时，API的RSD≤1.0%；制剂方◼法验证时，活性成份的RSD≤2.0%；杂质方法◼验证时，每个杂质的RSD≤20%。◼2.中间精密度◼原料药方法验证时，平行六份样品的RSD◼≤1.0%，两人之间的平均值之差≤1.0%。54

验证内容-精密度◼接受标准◼制剂方法验证时，平行六份样品的RSD≤2.0%，两人之间的平均值之差≤3.0%。◼杂质方法验证时，平行六份样品的RSD≤20.0%，两人之间的平均值之差如下：55验证内容-精密度◼注意问题◼以下因素可能

会影响到分析方法的精密度：◼1.仪器的设计和设置；◼2.样品的均一性；◼3.化验员的分析技术、所采用的试剂和环◼境；◼4.色谱峰的形状和分离度；◼5.分析方法的耐受性、回收率、波长的选择。56验证内容-精密度57验证内容-精密度58验证内容-精密度问题四◼精密度试验包括哪些？59

验证内容-检测限与定量限◼检测限系指在确定的试验条件下，试样中被测物能被检测出的最小量；◼定量限系指在确定的试验条件下，试样中被测物能被准确测定的最小量，其测定结果应具有一定准确度和精密度。◼杂质限度检查时应验证其方法的检测限，杂质定量检查时应验证其方法的定

量限。6061验证内容-检测限与定量限◼确定某一分析方法检测限和定量限的方法：◼1.目视法（直观评价，非仪器分析）◼可用于非仪器的分析方法，也可用于仪器的◼分析方法，用已知浓度的被测物，试验出能被可◼靠的检测出

的最低浓度或量；对于定量限需要有◼一定的准确度和精密度。62验证内容-检测限与定量限◼2.信噪比◼该方法适用于出现基线噪音的分析方法。◼信噪比的测定是通过比较含已知低浓度被分析◼物的样品与空白样品的测试信号，确定被分析

◼物可被确切地检测的最小浓度，典型的信噪比◼为3:1；对于定量限典型的信噪比为10:1。63验证内容-检测限与定量限64验证内容-检测限与定量限65问题五◼检测线和定量限的确定方法有哪些？66验证内容-线性◼线性系指在设计的测定范围内，检测结果与供试◼品中

被分析物的浓度（量）直接呈线性关系的程◼度。◼线性是定量测定的基础，涉及定量测定的项目，◼如杂质定量检查、含量和溶出方法均需要验证其◼线性。◼可用一贮备液经精密稀释或分别精密称样，制备◼一系列的供试品进行测定，至少制备5个浓度◼（通常选取50

％,80%,100%,120%和150％）。67验证内容-线性◼并且80%,100%和120%的数据也可以用来确定方法重现性。◼以测得的响应信号作为被测物浓度的函数作图，观察是否呈线性，用最小二乘法进行线性回归。◼必要时，响应信号可经数学转换，再进行线性回归计算。68

验证内容-线性◼接受标准69验证内容-线性◼注意问题◼1.监测器的设计和型号；◼2.流动相和被分析物的紫外特性；◼3.色谱峰的完整性。70验证内容-线性71验证内容-线性72验证内容-范围◼范围系指能达到一定精密度、准确度和线性，测◼试方法适用的高低限浓度或量的区间。◼杂

质定量检查、含量和溶出方法均应验证其范围，分析方法的范围应根据具体分析方法以及对线性、准确度、精密度的结果和要求确定。◼范围通常用与分析方法测试结果相同的单位（如◼百分浓度）表达。涉及到定量测定的检测项目均◼需要对范围进行验证，如含量测定、含量均匀度、溶出度或释放度、杂质定量试

验等。73验证内容-范围◼接受标准◼①对于半成品或者成品含量测试，范围通常为◼测试浓度的80%-120%；◼②对于杂质测试，范围为测试浓度的50%-◼120%；◼③对于含量均匀度测试，除了基于剂型本身特◼点（例如：计量

剂型气雾剂、喷雾剂）而确定的◼更宽的范围外，范围应为测试浓度的70％～130◼％；74验证内容-范围验证内容-耐用性◼耐用性系指测定条件发生小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。耐用性主要考察方法本身对于可变试验

因素的抗干扰能力。开始研究分析方法时，就应考虑其耐用性。如果测试条件要求苛刻，则建议在方法中予以写明。7576验证内容-耐用性◼典型的液相色谱法中变动因素包括：◼•流动相PH（±0.5)◼•流动相组成(有机相±5%）◼•色谱柱（同一厂家的三个批号，或两个不同厂家（同固定相和填充物，尺寸

）◼•温度（20-25C)和流速(±10%）◼•检测波长(±5nm)77验证内容-耐用性◼典型的气相色谱法中变动因素包括：◼•色谱柱（同一厂家的三个批号，或两个不同厂家（同固定相和填充物，尺寸）◼•流速◼柱温◼进样口和检测器温度

等。验证内容-耐用性◼在评估参数时需要获得改变条件后与标准条件下的测量结果，通过对改变条件后与标准条件下结果的比较来评估方法的耐用性。◼改变条件后与标准条件下结果的差异计算公式如下:%Difference=100-100×

Rm/Rs◼其中：◼Rm改变条件后的含量结果；◼Rs标准条件获得的含量结果。78验证内容-耐用性◼接受标准◼1.原料药和制剂：◼主要成分的含量差异不得大于1.5%。◼2.杂质：79验证内容-耐用性80验证内容-问题六◼方法验证的内容包括哪些

？81方法确认◼适用于药典方法和其他已验证的法定标准。因为药典方法和其他法定标准被认为是验证过的分析方法，不需要验证，但需要通过方法确认来证明方法在该实验室条件下的适应性。82方法确认◼对于方法确认，通常采用两种方式：◼一、由

两名检验人员分别独立对同一批产品进行检验（如可能使用不同的仪器）比较两人的检测结果来证明方法在本实验室（人员，分析仪器，试剂）的适用性；◼二、根据验证目的和评估结果选择相关项目进行确认：（具体见下表）83方法确认

84方法再验证◼在某些情况下，如原料药合成工艺改变、制剂处方改变、分析方法发生部分改变等，均有必要对分析方法再次进行部分或完整的再验证，以保证分析方法可靠。◼85方法再验证◼当原料药合成工艺发生改变时，可能引入新的杂质，杂质检查方法和含量测定方法的专属性就需要再进行验证，以证明有关

物质检查方法能够检测新引入的杂质，且新引入的杂质对主成份的含量测定应无干扰。86方法再验证◼当制剂的处方组成改变、辅料变更时，可能会影响鉴别的专属性、溶出度和含量测定的准确度，因此需要对鉴别、含量测定方

法再验证。◼当原料药产地来源发生变更时，可能会影响杂质检查和含量测定的专属性和准确度，因此需要对杂质检查方法和含量测定方法进行再验证。87方法再验证◼再验证原则：根据改变的程度进行相应的再验证。当这种

改变到达一定程度时，则需要完整的验证。如分析方法完全改变时，则应视为新方法并需要完整的验证。◼譬如：质量标准中某一项目分析方法发生部分改变时，如采用高效液相色谱法测定含量时，检测波长发生改变，则需要重新进行检测限、专属性、准确度、精密度、线性等内容的验证，证明修订后分析方法的合理性、可行性。

88方法再验证◼方法再验证是对分析方法的完善过程，应根据实际改变情况进行再验证，从而保证所采用的分析方法能够控制药品的内在质量。89参考资料◼2010版GMP法规；◼2010版GMP实施指南；◼ICHQ2

◼FDAcGMP（21CFR211）◼USP1225；90参考资料◼网址：◼ICH◼◼•Q2A:TextonValidationofAnalyticalProcedures◼•Q2B:ValidationofAnalyticalprocedures:◼Methodology91

参考资料◼网址：◼EU:◼•CPMP/ICH/381/95(ICHQ2A:adoptedNov94atstep5)◼•CPMP/ICH/281/95(ICHQ2B:adoptedDec96atstep4)92参考资料◼网址：FDA◼•GuidelineforIndustry:Valida

tionofAnalyticalprocedures:Methodology(FederalRegister,May97,62FR27464)◼•GuidelineforIndustry:Texton

ValidationofAnalyticalProcedures(FederalRegister,Mar95,60FR11260)93参考资料◼网址：◼USP:<1225>‘ValidationofCompendialProcedures’◼•standardapplie

dtomonographmethods◼•harmonisedwithICHQ2AandQ2B(butnotidentical)94参考资料◼网址：◼BP2005:SupplementaryChapt

erIIID.‘Monograph◼Development:MethodsofAnalysis’◼•concernsmethodsdescribedintheBP◼•doesnotdetailvalidationrequire

ments◼•referstoICHandWHO95参考资料◼网址：◼JPXIV:GeneralInformationChapter16‘Validation◼ofAnalyticalProcedures’◼•doesnotcrossreferenc

eICH(somesimilarity,some◼differences)96参考资料◼网址：◼WHO:TechnicalReportSeries823,Annex5,199297谢谢大家98