【文档说明】第5章细菌的遗传与变异医学微生物学课件.ppt，共(92)页，2.453 MB，由小橙橙上传

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改变花色的转基因矮牵牛花转入荧光素酶蛋白基因的发荧光烟草蓝色玫瑰一直是人类美丽的梦想基因工程已将它变为现实转基因西红柿由于细菌个体微小、遗传物质较为简单，易于人工培养，繁殖速度快，突变型容易识别和检出。因此，细菌一直被用做研究生物遗传

与变异规律的实验材料。利用人工诱变或杂交选育医药或食品工业中所需要的高产菌株。利用分子生物学技术，构建“基因工程菌”，生产新药、疫苗、食品添加剂，或者用于环保等。一、细菌遗传的物质基础二、细菌的基因小胸泳衣突变三、细菌的基因转移与重组四、微生物基因

组学五、基因工程菌株的构建细菌的遗传与变异1、细菌染色体基因组结构细菌染色体是一个裸露的闭合环状的双链DNA分子，有核蛋白，缺乏组蛋白，无核膜包裹。一、细菌遗传的物质基础细菌基因组结构的主要特征：（1）遗传信息是连续的，不含内含子。很少有

重复序列。（2）通常，编码相关功能的基因高度集中，组成操纵子（operon）结构，自一个启动子开始转录成多基因的mRNA分子，翻译成多种功能相关的蛋白质。一、细菌遗传的物质基础2、质粒（plasmid）一、细菌遗

传的物质基础是细菌染色体外的遗传物质，大多由闭合环状双链DNA组成。●具有自我复制的能力。●所携带的基因赋予宿主菌某些生物学性状（如F质粒、R质粒、毒力质粒、代谢质粒），增加小胸泳衣细菌的存活机会。●非生存所必需，可自行丢失或消除。●可在细菌之间转移。质粒DNA的特征一、细菌遗传的

物质基础❖1)致育质粒（F质粒）与有性生殖功能关联；❖2)耐药性质粒编码细菌对抗菌药物或重金属盐类的耐药性。分两类，一是接合性耐药质粒（R质粒），另一是非接合耐药性质粒；❖3)毒力质粒（Vi质粒）http://www.yibangzi.com编码与该菌致病性有关的毒力因子；❖4)

细菌素质粒编码细菌产生细菌素；❖5)代谢质粒编码产生相关的代谢酶。一、细菌遗传的物质基础3、转座子（transposon）一、细菌遗传的物质基础是一个DNA片段（＞2kb），可在质粒与质粒之间或质粒与染色体之间随机转移，故又称为“跳跃基因”。转座子不能自我复制。转

座子质粒转座子的结构特点●2个末端反向重复序列：能为整合酶所识别，与插入功能有关。一、细菌遗传的物质基础●中心序列：带有遗传信息，如常带有耐药基因、细菌毒素基因、整合酶（或转座酶）基因。一、细菌遗传的物质基础当转座子插入到

某一基因组中，可能会产生什么遗传学效应？一、细菌遗传的物质基础●可引起插入基因失活，产生基因突变。●在插入部位又出现一个或多个耐药基因，使细菌产生耐药性或多重耐药性。4、噬菌体（bacteriophage）一、细菌遗传的物质基础噬菌体是感染细菌、真

菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒。转座子质粒一、细菌遗传的物质基础二、细菌的基因突变三、细菌的基因转移小胸泳衣与重组四、微生物基因组学五、基因工程菌株的构建细菌的遗传与变异基因突变（genemutation）

：细菌染色体基因发生突然而稳定的结构改变，包括一对或少数几对碱基的缺失、插入或置换（点突变：pointmutation），导致细菌性状的遗传性变异。1、概念二、细菌的基因突变●随机发生，不定向●稳定●自发突变产生频率为10-10～10-6●可诱发性：野生株、

突变株2、特点二、细菌的基因突变●耐药性突变：选择标记●毒力突变：疫苗研制、新现传染病●营养缺陷体突变：新药诱变作用检测●高产突变：抗生素等药品、食品生产●抗原性突变：逃逸免疫机制3、突变现象二、细菌的基因突变日本发生过一次细菌性痢疾大流行。从病人粪便中分离到大量的

痢疾杆菌敏感株和耐药株（同时耐链霉素、氯霉素、四环素、磺胺类），且大肠杆菌与痢疾杆菌有完全相同的多重耐药性。多重耐药性传播迅速。耐药菌在传代、保藏过程中可自发失去耐药性。能否用基因突变解释以上现象？三

、细菌的基因转移与重组一、细菌遗传的物质基础二、细菌的基因突变三、细菌的基因转移与重组四、微生物基因组学五、基因工程菌株的构建细菌的遗传与变异供体菌（donor）将遗传物质转移至受体菌（recipient），使后者获得新的生物学性状，称为基因转移（genetr

ansfer）。细菌通过水平方向的基因转移和重组，产生新的基因型个体，以适应随时改变的环境。基因转移的概念三、细菌的基因转移与重组●质粒（plasmid）●转座子（transposon）●温和噬菌体（temp

eratephage）基因转移的元件三、细菌的基因转移与重组●接合（conjugation）●转化（transformation）●转导（transduction）●转座（transposition）基因转移的方式三、细菌的基因转移与重组1、接合（con

jugation）三、细菌的基因转移与重组接合：供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触，并将遗传物质（主要是质粒DNA）转移给受体菌，http://www.yibangzi.com使受体菌获得新的遗传性状。三、细菌的基因转移与重组质粒质粒接合转移示意图染色体性菌毛受体菌供体菌三、细菌的基因转移与重组赋

予宿主菌的耐药性编码性菌毛，决定自主复制与接合转移耐药性（R）质粒三、细菌的基因转移与重组R质粒主要以接合方式从耐药菌传递给敏感菌，使后者变为耐药菌。R质粒在同一种属或不同种属细菌之间传递，造成耐药性的广泛传播，尤其在肠道杆菌中比较普遍，给临床治疗带

来很大困难。三、细菌的基因转移与重组日本发生过一次细菌性痢疾大流行。从病人粪便中分离到大量的痢疾杆菌敏感株和耐药株（同时耐链霉素、氯霉素、四环素、磺胺类），且大肠杆菌与痢疾杆菌有完全相同的多重耐药性。多重耐药性传播迅速。耐

药菌在传代、保藏过程中可自发失去耐药性。能否用基因突变解释以上现象？三、细菌的基因转移与重组F+F-F+F-F+F+F+F+DonorRecipient三、细菌的基因转移与重组F+F+Hfr三、细菌的基因

转移与重组HfrF-HfrF-HfrF-HfrF-三、细菌的基因转移与重组F’F’F’F’F’F-F’F-三、细菌的基因转移与重组雄性菌株Hfr菌株F́́菌株Ｆ－菌株（雌株）Ｆ因子和接合F+菌株三、细菌的基因转移与重组F×F+F+F++F×+FFF×+FHfr

HfrF（多数情况下）F×+HfrHfrHfr（少数情况下）雄性菌株与雌性菌株接合结果三、细菌的基因转移与重组Griffith肺炎链球菌感染小鼠实验（1928）无荚膜活菌有荚膜活菌有荚膜死菌三、细菌的基因

转移与重组有荚膜的活菌？三、细菌的基因转移与重组活的无荚膜肺炎链球菌从死的有荚膜肺炎链球菌中获得荚膜（毒力决定因子）编码基因，称之为转化（transformation）。引起转化现象的物质称为转化因子。Avery研究

揭示，转化因子的本质是DNA，即遗传物质是DNA。1944年，获得诺贝尔医学生理学奖。三、细菌的基因转移与重组2、转化（transformation）三、细菌的基因转移与重组转化：受体菌从周围环境中直接摄取供体菌游离的DNA片段，并整合

入受体菌基因组中，从而获得供体菌部分遗传性状的过程。三、细菌的基因转移与重组（1）转化的前提条件●供体菌DNA片段的大小：＜10～20个基因●供体DNA性质：同源性高的、未变性的双链DNA；质粒DNA。●受体菌的生理状态：处于“感受态”三、细菌的基因转移与重组（2）自然转化过程三、细菌的基因转

移与重组1、受体菌处于感受态(competence)Ca2＋诱导法、电穿孔法受体细胞经过一些特殊方法处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。②转化因子的结合与进入

双链DNA与感受态受体菌表面的DNA结合受体结合。其中一条链被降解产生能量；另一条链与特异DNA结合蛋白形成复合物，进入菌体内。三、细菌的基因转移与重组③转化因子的整合单链DNA不经复制，与受体菌同源DNA区段的单

链配对，被取代的受体菌DNA单链被降解，最终产生转化子。三、细菌的基因转移与重组有荚膜的活菌？三、细菌的基因转移与重组3、转导（transduction）三、细菌的基因转移与重组以温和噬菌体为媒介，将供体菌DNA片段（染色体DNA、非接合性质粒DNA）转移到受体菌内，通

过基因重组而使受体菌获得新的遗传性状。三、细菌的基因转移与重组（1）转导的概念●是感染细菌、放线菌、真菌等的病毒。●分为头部和尾部。头部由核心（核酸）和衣壳（蛋白质）构成。●能通过细菌滤器。●须寄生在活的易感宿主菌体内。三、细菌的基因转移与重组（2）噬菌体（phage）（3）温和噬菌体烈（毒

）性噬菌体（virulentphage）：噬菌体在宿主菌体内复制增殖，产生大量子代噬菌体，并最终裂解细菌，建立溶菌周期。三、细菌的基因转移与重组三、细菌的基因转移与重组温和噬菌体（temperatephage）：感染宿主菌后，不立即增殖，而是将其核酸整合到宿主菌染色

体基因组中，与宿主菌DNA一起复制，并随细菌的分裂而传至子代细菌。前噬菌体溶原性细菌有些温和噬菌体可使溶原性细菌的表型发生相应改变，称之为溶原性转换（lysogenicconversion）。例如，白喉棒状杆菌若携带β噬菌体时，可产生白喉毒素。三、细菌的基因转

移与重组溶原性细菌能正常以二分裂方式繁殖，前噬菌体也一代一代传下去。但有时也会自发终止（发生率10-5），从染色体上脱落，进入溶菌周期。三、细菌的基因转移与重组（4）转导的机制前噬菌体从染色体上脱离进行增殖，装配成新的子代噬菌体。大约在105～107次装配中发生一次错误，误将大小

合适的供体菌DNA片段装入噬菌体头部，成为“假噬菌体”。三、细菌的基因转移与重组假噬菌体供体菌当“假噬菌体”（转导噬菌体）再度感染受体菌时，将供体菌DNA带入受体菌内。完全转导与流产转导普遍性转导、局限性

转导三、细菌的基因转移与重组假噬菌体受体菌供体菌DNA4、转座（transposition）三、细菌的基因转移与重组转座子在质粒之间或质粒与染色体之间的自行转移现象，称之为转座。转座子能在2个没有任何同源性

的基因组之间转座（即插入到某一基因），并能引起一系列遗传效应。●可引起插入基因失活，产生基因突变。●在插入部位引入一个或多个新的基因（如耐药基因、毒素基因。三、细菌的基因转移与重组转座子的自行转移不需要核苷酸

碱基对同源才能插入，可在革兰阴性菌和革兰阳性菌之间转移。三、细菌的基因转移与重组一、细菌遗传的物质基础二、细菌的基因突变三、细菌的基因转移与重组四、微生物基因组学五、基因工程菌株的构建细菌的遗传与变异微生物基因组学

（Genomics）是利用全基因组DNA序列研究微生物基因及其功能的学科。四、微生物基因组学细菌是研究和分析基因组序列与相关生物学功能关系的理想模式。首先，用超声波将细菌染色体DNA随机切割成一定大小的DNA片段，插入到测序载体（质粒）中，以构建DNA文库

，进行大规模的测序，对DNA序列加以拼接。1、核苷酸序列测定四、微生物基因组学经过计算机分析，完成全基因组各个区域的编号和注释，最后存入数据库，并在互联网上发表，以供全世界的科学家参考和使用。四、微生物基因组学细菌全基因组序列测定完成后，更重要的任务是鉴定基因及尽可能确定基因的功能，称之为后基因

组学。2、微生物基因组结构与功能研究四、微生物基因组学3、微生物基因组学研究的意义四、微生物基因组学根据病原菌全基因组序列，应用现代生物信息软件对基因序列进行分析，可确定哪些基因与毒力、体内定居或体内持续感染有关，从而阐明病原菌致病基因及其产物。（1）揭示病原微生物的致病机制四、微生物

基因组学从分子和细胞水平上，揭示微生物与宿主之间的相互作用，更深入地阐明病原微生物的致病机制，诸如毒素作用机制、宿主细胞中微生物的受体，侵入细胞内微生物的定位和新表位的发现，对宿主免疫系统的反应等。四、微生物

基因组学（2）建立灵敏特异的基因诊断技术传统的病原体诊断依赖于致病微生物的形态、培养和生化特征。通过测定多种致病与非致病微生物的基因组序列，可以获得大量的基因信息。如特异DNA序列用于诊断，菌株特异性基因用于分型。四、微生

物基因组学图2引物特异性单重PCR电泳结果m100bpMarker，1CMCC51252,2CMCC51572,3CMCC51592,4GIM-Shi1,5GIM-Shi2,6ATCC9027,7ATCC15442,8CMCC10104,9GIM-Ps,10ATCC43889,11GDCIQ

-O157-1,12GDCIQ-O157-2,13CMCC50093,14CMCC50071,15CMCC50115,16CMCC47001,17GIM-Vp,18GDCIQ-Vp（3）开发新型抗菌药物病原菌全基因组序列的测定，一方面，能揭示细菌耐药的确切

机制，对现有抗菌药物进行改造或开发新型药物。四、微生物基因组学另一方面，可使药物的研发策略从筛选化合物库转向优先筛选靶位基因，即以病原菌为目标，找出在人类基因组中缺失，对耐药菌生存必不可少并在感染过程中优先表达的基因；选择这些基因作为抗菌药

物的靶位点，可设计出具有针对性很强的药物（窄谱抗生素）。四、微生物基因组学病原菌全基因组序列的测定，还可大大加速新疫苗的研制。（4）开发新型疫苗四、微生物基因组学通过生物信息学软件，对全基因组序列进行分析，可预测出病原体的具有很高免疫原性

的保护性抗原及其表位。将抗原或表位编码基因在合适的载体系统中表达，分离纯化目的抗原或表位。最后，检测抗原的安全性和有效性。四、微生物基因组学随着微生物基因组被解码和微生物功能基因组的研究与开发，微生物学正面临着革命性的飞跃。微生物基因组研究所获得的信息将迅

速转化为生产力，微生物感染性疾病的诊、防、治，将会彻底得到改观。四、微生物基因组学一、细菌遗传的物质基础二、细菌的基因突变三、细菌的基因转移与重组四、微生物基因组学五、基因工程菌株的构建细菌的遗传与变异目的基因＋重组质粒转化→目的蛋白五、基因工程菌株的构建重组DNA技

术基因工程菌五、基因工程菌株的构建质粒作为一种独立的复制子，容易从细胞中分离出来、在体外进行遗传操作和转入到合适的受体细胞中，表达外源目的基因。●自主复制，可表达外源基因●限制性酶切位点●选择性标记（耐药性）五、基因工程菌株的构建质粒可作为表达载体

，首先在体外构建重组质粒（携带目的基因）；再转入原核表达系统（大肠杆菌）或真核表达系统（酵母菌）中，构建“基因工程菌株”；大量表达目的基因，获得目的蛋白（如氨基酸、味精、抗生素、胰岛素、干扰素、生长激素、乙肝疫苗）。五、基因工程菌株的构建幽门螺杆菌（Helicobacterpylori，Hp）是慢

性活动性胃炎和消化性溃疡的致病菌，并与胃腺癌和胃部淋巴瘤的发生密切相关。立论依据五、基因工程菌株的构建我国人口Hp感染率为70%。目前主要采用的抗生素疗法（三联药物:埃索美拉唑＋阿莫西林＋克拉霉素）的疗效不甚理想，易复发。疫苗被认为是控制Hp感染最有效的方法。五、基因工程菌株的构建●全菌灭活疫苗

●亚单位疫苗由于以上疫苗各自的缺陷，目前尚无安全、有效的疫苗应用于临床。鉴于Hp经黏膜途径入侵人体，黏膜免疫在抗感染免疫中起有重要作用。五、基因工程菌株的构建构建高效表达幽门螺杆菌保护性抗原-黏附素的重组嗜酸乳酸菌

，作为活载体口服疫苗，诱发有效的局部免疫应答，保护机体抵抗感染。五、基因工程菌株的构建设计幽门螺杆菌黏附素Bab引物，引入酶切位点培养幽门螺杆菌标准菌株抽提核酸PCR扩增Bab基因构建表达载体pMD18-T转化进E.coliDH5α受体菌，筛选转化成功的细菌抽提质粒双酶切，鉴定，回收Bab片断克

隆入嗜酸乳杆菌质粒pMG36e电穿孔法转化在嗜酸乳杆菌中表达，获得重组嗜酸乳杆菌鉴定目的蛋白表达效果pMG36e是组成型表达质粒载体，可在乳酸菌、大肠杆菌中自我复制。大小为3.6kb，含红霉素耐药基因、P32启

动子、多克隆位点和prtp转录终止子。实验结果引物设计:P15’-GGAATTCATGAAAACATTTGAA-3’EcoRIP25’-GCTCGAGTTAAGCCAAATGGGC-3’XhoI五、基因工程菌株的构建2000bp1000bp750bp500bp250bp100

bp①PCR扩增Bab基因五、基因工程菌株的构建②Bab基因测序及序列分析五、基因工程菌株的构建③Bab基因克隆至表达载体bp100015000750050002500M121：EcoRI/XhoI双酶切重组质粒2：PCR扩增Bab基因五

、基因工程菌株的构建-5.0-4.0-3.0-2.0-1.00.01.02.03.04.05.011443773109napA.seq_TranslationHydrophilicityPosition④Bab生物信息学分析五、基因工程菌株的构建⑤Bab在嗜酸乳杆菌中的

表达M123Kda97.466.243.031.020.114.4Kda97.466.243.031.020.114.4M12五、基因工程菌株的构建哈哈，下课了!