【文档说明】第九章-PCR技术及其在医学上的应用课件.ppt，共(47)页，1.248 MB，由小橙橙上传

转载请保留链接：https://www.ichengzhen.cn/view-247036.html

以下为本文档部分文字说明：

第九章PCR技术及其在医学上的应用TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1993"forcontributionstothedevelopmentsofmethodswithinDNA-basedchemistry"M

ichaelSmith1944-1932-2000LaJolla,CA,USAKaryB.MullisUniversityofBritishColumbiaVancouver,Canada"forhisinventionofthepolymerasechainreactio

n(PCR)method""forhisfundamentalcontributionstotheestablishmentofoligonucleotide-based,site-directedmutagenesisanditsdevelopmentforproteinstudies"一、

PCR基本原理•DNA模板变性：95℃左右高温变性•单链DNA模板与引物退火：引物与模板形成复合物的几率>>DNA分子自身的复性•引物的延伸•一个PCR循环即“变性—退火—延伸”•经过30个左右的循环后，PCR的扩

增倍数为(1+x)n,x=75%,n为循环数第一节PCR原理与特点BABBABAABABABABA靶序列未扩增的DNA循环1变性退火延伸循环2变性、退火延伸A上游引物B下游引物PCR示意图5'端是人工合成的引物，是特定的，3'端没有固定的终止点特定的的扩增产物在

第2个循环中出现，以后快速扩增，成为主要扩增产物BBAABABAABBABAABBABBAABABABA循环3变性、退火延伸n个循环后，5'端是特定的人工合成的引物，3'端没有固定的终止点的DNA链扩增量为2n。•Taq聚合酶的性能•模板DNA的拷贝数•底物dN

TP浓度•其他多种因素30个循环后出现“平台效应”平台效应出现的早晚取决于：二、PCR技术的特点•高度的敏感性：是最主要的特点，25个循环可扩增106倍，它可对单拷贝、单根头发、一滴血等微量标本进行分析•高度的特异性：取决于2个引物设计的好坏，依赖于引物与模板结合的

正确性，退火温度•操作简便、快捷•适用样品的广泛性第二节PCR系统的组成及PCR最适条件•耐热DNA聚合酶•寡核苷酸引物•dNTP•PCR反应缓冲液•模板DNA•PCR循环数•易发生的问题及解决方法一、

耐热DNA聚合酶必需金属离子Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+3'→5'外切活性－－＋－5'→3'外切活性＋＋＋＋逆转录活性＋(Mn2+)＋(Mn2+)未定未定耐受100℃－－＋＋该酶的出现使PCR操作大大简化，克服了以前每一

循环反复加Klenow酶的缺点各种耐热DNA聚合酶的特性TaqTthVENTSacTaqDNA聚合酶的种类•天然酶---嗜热水生菌分离纯化•基因工程酶---AmlpiTaqTM•5'→3'DNA聚合酶•在Mn2+存在下，逆转录酶活性最佳•有5'→3'外切酶活性•无3'→5'外切酶活性，

无校正功能•PCR产物末端加1个非模板依赖性碱基，优先为A，是TA克隆的基础TaqDNA聚合酶的特性TA克隆定义利用嗜热聚合酶如Taq聚合酶的模板非依赖性末端转移酶活性(在70～75℃活性高)，使PCR产物的3′末端加一个A的粘性端，将其直接克隆至3′粘性末端含一个T的线性

克隆载体中.TA克隆方法(一步PCR克隆)PCR扩增+连接转化蓝白筛选校正聚合酶平端PCR产物Taq酶dATP二、寡核苷酸引物•引物长度在15～30个碱基，人基因组有3×109bp，19mer引物：419×1011中重复1次.•引物的碱基的分布是随机的,避免5个以上的嘌啶和嘧啶的连续排

列,尤其3'不应有连续3个G或C•避免两引物间的互补,特别是3'端•引物自身不应有连续超过3个bp的互补序列•引物的3'端不能有任何修饰,3'决定产物的特异性•引物的5'端限定PCR产物的长度,5'端可进行修饰•引物与非扩增序列同源性应<70%或

<连续8个互补•扩增编码区中,引物3'端不要终止于密码子的第3位引物的设计直接关系到PCR的特异性与成败引物的设计原则---现有引物设计程序或软件PCR反应引物的常用浓度范围PCR反应中引物的浓度是～

1μmol/L在100μl中引物的量为25～100pmol,假如用25μmol/L浓度的引物贮备液只需加1～4μl三、dNTP•dNTP是dATP，dCTP，dGTP，dTTP的总称•dNTP在50次循环中是稳定的•dNTP在PCR中的常用浓度是20～20

0μmol/L•试剂公司已将其pH调至7.0～•要避免反复冻融,分装冻存于-20℃•每种贮存液浓度为5～10mmol/L,一般为10mmol/L,4种合并后浓度即为2.5mmol/L•100μl的PCR反应中,假如用各2.5mmol/L浓度的dNT

P混合液贮备液只需加～8μl•注意Mg2+浓度与dNTP浓度之间的关系四、PCR反应缓冲液•Tris-Cl（pH～8.8)•KCl(50mmol/L)或(NH4)2SO4(25mmol/L):促使引物退火•MgCl2(25mmol/L):影响酶活与精确度,产物的特异性•明胶(5%)或BSA或T

ween-20:稳定酶活性•甲酰胺(5%):使引物与模板特异性配对五、模板DNA•来源：广泛•要求：待扩增部分需部分纯化•用量：ng的量克隆DNA，μg水平的染色体DNA•抽提方法：简单的水煮沸法去垢剂裂解细胞→蛋白酶消化蛋白→有机溶剂抽提→乙醇沉淀核酸•扩增产物长度：检测性的长度一般为500

bp(100～300bp为好)；克隆片段则不受此影响六、PCR循环数•其他参数选定后,PCR循环数主要取决于模板DNA的浓度•PCR循环数一般为25～30七、易发生的问题及解决方法•假阴性•假阳性•PCR产物呈片状•非特异性扩增易发生的问题假阴性•是否加入Taq聚合酶，酶活性

如何？•DNA解链是否充分，PCR仪在变性可否达到解链温度•样品中有酶抑制剂，95℃，10min•使用多组分引物，作双重PCR解决方法假阳性•设立阴性对照、空白对照•避免操作污染•避免阳性对照以检测样品的污染解决方法PCR产物呈片状•减少聚合酶浓度•增加退火温度•减

少循环数解决方法非特异性扩增•增加退火温度，减少退火时间及延伸时间•降低引物与聚合酶浓度•改变Mg2+的浓度解决方法第三节PCR技术的发展•外源基因的分离•基因重组•DNA测序•构建克隆或表达载体•定点突变•

检测某基因的多态性•转座子插入位点绘图•检测基因修饰PCR及其衍生技术的应用TA克隆定义利用嗜热DNA聚合酶如TaqDNA聚合酶的模板非依赖性末端转移酶活性(在70～75℃活性高)，使PCR产物的3′末端

加一个A的粘性端，将其直接克隆至3′粘性末端含一个T的线性克隆载体中.TA克隆方法(一步PCR克隆)PCR扩增+连接转化蓝白筛选校正聚合酶平端PCR产物Taq酶dATP•PCR克隆技术•PCR直接测序技术•定量PCR•PCR体外定点突变•PCR与突变的分子水平

分析•修饰PCR•不对称PCR•反转录PCR•通用引物PCR•套式PCRPCR及其衍生技术的种类•单一特异性引物PCR•随机引物PCR•倒向PCR•免疫PCR•碱基替代PCR•锚式PCR•mRNA差别

显示•原位PCR•膜结合PCR•简并引物PCR第四节PCR技术在医学上的应用•感染性疾病病原体的诊断和研究•遗传病相关基因的检测•恶性肿瘤的诊断和研究•法医学研究•在骨髓移植配型中的应用一、感染性疾病病原体的诊断和研究•对形态和生化反应不典型的微生物病原体的鉴定•解决混合标

本问题•生长缓慢或难于培养的病原体的鉴定•难于鉴定的病原体诊断•HIV•HCV与HEV•HPV•结核杆菌•其他病原微生物•鉴定新病毒二、遗传病相关基因的检测•巴氏水肿胎儿的产前诊断•镰形细胞贫血•杜氏营养不良

症（DMD）•甲型血友病•胎儿性别鉴定巴氏水肿胎儿综合征•α-地中海贫血中最严重的一种。•4个α-珠蛋白基因全部缺失（1条染色体应有2个珠蛋白基因），γ-珠蛋白形成γ4，即HbBarts，对氧亲和力极高，常致胎儿窒息死亡。•广东、广西多发巴氏水肿胎儿的产前诊断•

设计1对引物PCR扩增α-珠蛋白基因。同时增加1对引物扩增β-珠蛋白基因作内对照•正常胎儿可扩增出136bp片段•巴氏水肿胎儿不能扩增136bp片段镰形细胞贫血•原因：β-珠蛋白链第6位的GAG→GTG，造成Glu→Val所致。•设计一对引物PCR扩

增可得294bp，OxaNI消化，电泳294191103bpAA：正常人BB：纯合子病人CC：杂合子病人杜氏营养不良症（Duchennemusculardystrophy,DMD）•男性常见的致死性X性连锁隐性遗

传病•以往检测基因缺陷方法：Southern印迹杂交•缺点：须用10余种探针，操作费时，同位素用量大，所需DNA量多，难于适应产前诊断的要求•PCR方法：设计9对引物，用于扩增9个易缺失区，一次PCR同时扩增，某

个片段无扩增则说明该段外显子缺失。针对可疑的男性胎儿进行DNA检测。•优点：方法简单，快速，便于临床使用。甲型血友病•最常见的遗传病凝血功能障碍所致的出血性疾病，为X性连锁隐性遗传病，是FⅧ基因缺陷所致•临床无满意治疗措施，检出携带者及产前诊断，防止

婴儿出生是降低发病率的主要措施。•首先明确胎儿性别，女性不必作基因诊断，男性可作下列PCR检测甲型血友病•PCR方法：设计1对引物，扩增FⅧ第18外显子内142bp，内含BclI。1429943bpAA：正常胎儿BB：男性有病胎儿PCR产物的BclI酶切后电泳结果胎儿性别鉴定预防性连锁

遗传病胎儿的出生应用切不可滥用，以免导致胎儿出生性别比例失调！•性连锁遗传病的分析•法医学的个人鉴定（如犯罪人员）•性器官发育异常的基因检测（包括一些运动员的性别鉴定）•指导性矫形手术出生后的性别鉴定应用•1990年确定决定人类性别的基因位于Y染色体短臂的1A1上，即SRY基因

（sex-determiningregionoftheY），染色体上如缺SRY，即发展成女性。•设计扩增人SRF基因和X、Y同源序列的2对引物进行PCR355289bpMM：maleFF：female590鉴定诊断率100%三、恶性肿瘤的诊断和研究•恶性肿瘤分子标记的检测及肿瘤残留细胞的监测•

癌基因、抗癌基因缺失与点突变的研究•肿瘤相关病毒基因的研究1.恶性肿瘤分子标记的检测及肿瘤残留细胞的监测•某些白血病与特定的染色体的易位或基因重排有关•如95%CML都存在ph染色体,产生t(9:22),形成ber/abl

融合基因,转录成嵌合mRNA•PCR检测:设计1对引物扩增ber/abl嵌合mRNA.•本法可检测1个ph阳性细胞/105正常细胞•该法也可用于淋巴瘤t(14:18)、(q32:q21)1.恶性肿瘤分子标记的检测及肿瘤残留细胞的监测•PCR法可检测

1～5个肿瘤残留细胞/104～105正常细胞•PCR为肿瘤的诊断、预后判断、微量残留细胞提供了快捷、正确的方法•以往检测缺失方法：较大缺失在显微镜下分析；微小缺失用印迹杂交•PCR法检测：简单•引物设计方法：①小缺失，设计1对引物分别

与缺失两侧的序列互补；②大缺失，在缺失区内设计1对•PCR检测缺失：①小缺失样品，扩增片段长度变短；②大缺失样品，无靶DNAPCR扩增产物•PCR检测突变方法：PCR-SSCP、引物竞争PCR和PCR直接测序法2.癌基因、抗癌基因缺

失与点突变的研究2.癌基因、抗癌基因缺失与点突变的研究小缺失大缺失AA：正常BB：缺失AA：正常BB：缺失缺失区缺失区3.肿瘤相关病毒基因的研究•HBV------与原发性肝癌•HPV•EBV---鼻咽

癌、Burkill’s淋巴瘤、传染性单核细胞增多症、何杰金氏病•HCMV---在宫颈癌、前列腺癌、肠癌和Koposi肉瘤中可检测到•HTLV-1(人类嗜T细胞白血病病毒)—慢性进行性脊髓病和T淋巴细胞白血病•HTLV-PCR可用于：淋巴细胞增生性疾病和神经系统的病人和携带者的检测与肿瘤相关的病毒

四、法医学研究•以往检测待测样品DNA的多态性方法：RFLP•缺点：较难获得量多且未降解的DNA•PCR法扩增特定的DNA序列•PCR法标本：头发、血斑、精斑或其他分泌物或组织块•PCR法结合指纹图谱分析和RFLP进行个体识别

、亲子鉴定、性别鉴定五、在骨髓移植配型中的作用•供者与受体之间的HLA必须相合才可进行BMT•经典的HLA配型方法：血清学或混合淋巴细胞培养法分析HLA基因型•PCR法可特异性扩增DNA序列，用于基因的多态性分析本章思考题试述PCR的基本原理和技术的特点