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资料仅供参考,不当之处，请联系改正。第六节蛋白质的测序(peptides)一、肽的定义与肽键二、肽的书写三、自然界中存在的小肽四、肽的理化性质资料仅供参考,不当之处，请联系改正。蛋白质肽链结构学说的证据：肽键是一个酰胺键。（1）蛋白

质水解前后的结果分析。（2）人工合成的多肽和天然蛋白质，都可被蛋白水解酶水解，人工合成多肽中氨基酸是肽键连接的。（3）天然蛋白质有双缩脲反应。（4）人工合成的聚合aa的X-光衍射谱和红外光谱与天然纤维蛋白相似。（5）结晶牛胰岛素的成功，完全证明了蛋白质肽

链结构学说的正确性。一、蛋白质中氨基酸之间的连接键是主要的是肽键资料仅供参考,不当之处，请联系改正。NH2COOH1NH2COOH2NH2CNCOOHOH21两个氨基酸分子头尾连接起来肽键的形成脱水Carbodi

imideJuangRH(2004)BCbasics资料仅供参考,不当之处，请联系改正。肽的结构与肽键资料仅供参考,不当之处，请联系改正。氨基酸借肽键连接的分子叫肽，肽是一大类物质，即：1）两个氨基酸组成的肽叫二肽；2）

三个氨基酸组成的肽叫三肽；3）多个氨基酸组成的肽叫多肽；4）氨基酸借肽键连成长链，称为肽链，肽链两端有自由-NH2和-COOH，自由-NH2端称为N-末端（氨基末端），自由-COOH端称为C-末端（羧基末端）；5

）构成肽链的氨基酸已残缺不全，称为氨基酸残基；6）肽链中的氨基酸的排列顺序，一般-NH2端开始，由N指向C，即多肽链有方向性，N端为头，C端为尾。二、肽的定义与结构资料仅供参考,不当之处，请联系改正。单位小分子N-C-C

-N-C-C-N-C-C-碳为中心N-C-C-N-C-C-N-C-C两端氨基酸N-C-C-N-C-C-N-C-C肽键的定位N-C-C-N-C-C-N-C-C肽的结构分析JuangRH(2004)BCbasics资料仅供参考,不当之处，请联系改正。肽的书写写法：从左→右，从N末端→C

末端。三字母用连线，也有用单字母的。读法：××酰—××酰—…—××酸。写法：Ser-Gly-Try-Ala-Leu或SGTAL，名称：丝氨酰-甘氨酰-酪氨酰-丙氨酰-亮氨酸资料仅供参考,不当之处，请联系改正。p轨道电子

共振使肽键具双键特性HCCNCOδ-δ+资料仅供参考,不当之处，请联系改正。NCCHNC●肽键虽是单键却有双键性质，不能自由旋转O●肽键周围六个原子在同一平面（酰氨平面）上●相邻两个氨基酸的-carbon在对角(trans)，反式C肽键的

特点sp2sp2●肽键亚氨基在pH0-14内不解离。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。Pro形成的肽链肽平面是可以反式也可以顺式。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。两肽键平面的交接点为a-碳以肽键平面连接成多肽长链注意a-碳上面接有各种大小不等的基团Mathewsetal(2000)

Biochemistry(3e)p.136资料仅供参考,不当之处，请联系改正。多肽链可以看成由C串联起来的数个酰胺平面组成氨基酸残基氨基酸残基资料仅供参考,不当之处，请联系改正。1、旋光性一般短肽的旋光度等于其各个氨基酸的旋光度的总和。2、肽的酸碱性质–短肽在晶体和水溶液中是以偶极离子形

式存在。–肽的酸碱性质主要取决于N端-NH２和C端-COOH以及侧链R上可解离的基团。–在长肽或蛋白质中，可解离的基团主要是侧链基团。三、肽的物理化学性质资料仅供参考,不当之处，请联系改正。pH优势离子的净电荷：<3.5+2

3.5-4.6+14.6-7.807.8-10.2-1>10.2-2等电点：2.628.76.4=+=pI3、肽的等电点：资料仅供参考,不当之处，请联系改正。⚫肽的-羧基，-氨基和侧链R基上的活性基团都能发生与游离氨基酸相似的反应。⚫双缩脲反应NH2-CO-NH-CO-NH2

(双缩脲），能与CuSO4-NaOH产生颜色反应。凡是有肽键结构的化合物都会发生双缩脲反应，可用于定量分析。双缩脲反应是肽和蛋白质特有的反应，游离氨基酸无此反应。4、肽的化学反应资料仅供参考,不当之处，请联系改正。1、谷胱甘肽（GSH）三肽（Glu-C

ys-Gly），广泛存在于生物细胞中，含有自由的巯基，具有很强的还原性，可作为体内重要的还原剂，保护某些蛋白质或酶分子中的巯基免遭氧化，使其处于活性状态。四、天然存在的活性肽NH2CHHOOCH2CH2CCOHNCHCOCH2SHHNCH2COOHGluCy

sGlyg-肽键资料仅供参考,不当之处，请联系改正。bg资料仅供参考,不当之处，请联系改正。2.促甲状腺素释放激素：三肽（焦谷氨酰组氨酰脯氨酸），可促进甲状腺素的释放。3.短杆菌素S：环十肽，含有D-苯丙氨酸、

鸟氨酸，对革兰氏阴性细菌有破坏作用，主要作用于细胞膜。4.青霉素：含有D—半胱氨酸和D—缬氨酸的二肽衍生物。主要破坏细菌的细胞壁粘肽的合成引起溶菌。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。5.牛催产素与加压素：均为九肽7

.脑啡肽：为五肽，具有镇痛作用。6.舒缓激肽：促进血管舒张，促进水、钠离子的排出。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。脑啡与其受体结合后可以产生镇痛效果麻啡可以模拟脑啡的作用，因此有类似的效用资料仅供参考,不当

之处，请联系改正。H3N+–CH–C–N–CH–C–O–CH3COO-CH2OOCH2HL-Aspartyl-L-phenylalaninemethylesterAspartame阿斯巴甜甜度是蔗糖的180倍资料仅供参考,不当之处，请联系改正。第四节蛋白质的结构Thestructureofpro

teins一、蛋白质的一级结构二、蛋白质的二级结构三、蛋白质的三级结构四、蛋白质的四级结构资料仅供参考,不当之处，请联系改正。一级结构蛋白质的四级结构氨基酸四级结构三级结构二级结构资料仅供参考,不当之处，请联系改正。一级结构（共价结构）：

蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序。一、蛋白质一级结构（初级结构）Primarystructure（一）、一级结构的研究内容与研究意义研究蛋白质的一级结构是研究蛋白质的结构与功能的基础，主要研究内容：1、氨基酸是如何连接成蛋白质，2、对于一定的蛋白质,氨基酸的排列顺序。3、

蛋白质r的一级结构测定过程。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。意义：1、研究蛋白质的一级结构是研究蛋白质结构与功能的基础，这是因为Pr的一级结构决定了它的高级结构，从而决定了蛋白质的生物功能。2、一级结构的研究为生物进化提供了依据，不同生物的同一种蛋白的其一级结构是不同的。3

、一级结构的研究为一些分子病的诊断提供了依据。只有将蛋白质的一级结构研究清楚后，生化工作者才能站到一个优越的地位去洞察，研究生命过程中的许多复杂问题。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。F.Sanger(1951,Cambridg

eU)Insulin胰岛素(A,Bchains)Nelson&Cox(2000)PrinciplesofBiochemistry(3e)p.142SSSSSS+NH3NH3+-OOCQGIVEQCCTSICSLYLENYCNCOO-FSFVNQHLCGHLVEALYLVCGERGFYTPKTB-c

hainA-chain（二）、蛋白质一级结构的测定NO2O2NF资料仅供参考,不当之处，请联系改正。阶段一：测序前的准备工作1、蛋白质一级结构的测定程序(1).确定蛋白质不同多肽链的数目(2).拆分蛋白质分子的多肽链，打开蛋白质分子中的二硫键(3).分离

纯化各自不同的多肽链(4).确定各多肽链的氨基酸组成分离提纯蛋白质，测定蛋白质的分子量资料仅供参考,不当之处，请联系改正。阶段二：多肽链的测序1、蛋白质一级结构的测定程序(1).特异性打断多肽链，产生适合测序大小的肽段(

2).分离纯化肽段(3).确定每一肽段的氨基酸顺序(4).采用另一种特异性试剂将多肽链打断,重复前三步.资料仅供参考,不当之处，请联系改正。阶段三：氨基酸顺序的拼接1、蛋白质一级结构的测定程序(1).利用重叠拼

接法拼接氨基酸顺序(2).确定多肽链之内和之间的二硫键的位置.SSSSSS+NH3NH3+-OOCQGIVEQCCTSICSLYLENYCNCOO-FSFVNQHLCGHLVEALYLVCGERGFYTPKTB-chainA-chain+NH3NH3

+-OOCQGIVEQCCTSICSLYLENYCNCOO-FSFVNQHLCGHLVEALYLVCGERGFYTPKTB-chainA-chainCOO-FLYLVCGERGFYTPKTNH3+SFVNQHLCGHLVEAB-chain资料仅供参考

,不当之处，请联系改正。①N-末端分析A.化学法DNS-Cl法：最常用，黄色荧光，灵敏度极高，DNS-多肽水解后的DNS-氨基酸不需要提取。DNFB法：Sanger试剂，DNP-多肽，酸水解，黄色DNP-氨基酸，有机溶剂（乙酸乙酯）抽提分离，纸层析、薄层层析、液相等。PITC法：Edman法

，逐步切下。无色PTH-氨基酸，有机溶剂抽提，层析。2、N-末端和C-末端氨基酸残基的的鉴定资料仅供参考,不当之处，请联系改正。①N-末端分析B.酶法（氨肽酶法）从多肽链的N-末端逐个地向里切。根据不同

的反应时间测出酶水解所释放的氨基酸种类和数量，按反应时间和残基释放量作动力学曲线。亮氨酸氨肽酶：最常用氨肽酶M：较常用2、N-末端和C-末端氨基酸残基的的鉴定Gly-Ser-Val资料仅供参考,不当之处，

请联系改正。①N-末端分析C.常见问题及处理方法：2、N-末端和C-末端氨基酸残基的的鉴定经常碰到N-末端残基的氨基被封闭。因此不能与Edman降解试剂发生作用。焦谷氨酰化、乙酰化以及某些环状肽。NHOCONHpeptideenzymeNHOCOOHNH2peptide+焦谷氨

酸氨肽酶资料仅供参考,不当之处，请联系改正。②C-末端分析A.肼解法无水肼NH2NH2100℃5-10h。苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼，C端游离氨基酸留在上清中。Gln、Asn、Cys、Arg不能用此法。2、N-末端

和C-末端氨基酸残基的的鉴定资料仅供参考,不当之处，请联系改正。②C-末端分析B.还原法,硼氢化锂(LiBH4)肽-COOH→生成肽-CH2OH→水解,分离,层析鉴定。此法比较少用。C.羧肽酶法，（Pro不能测）2、N-末端和C-末

端氨基酸残基的的鉴定羧肽酶A：除Pro、Arg、Lys外的所有C端a.a羧肽酶B：只水解Arg、LysVal—Ser—Gly资料仅供参考,不当之处，请联系改正。①.多肽链之间的连接方式A.共价键二硫键-S-S-酰

胺键-CO-NH-酯键-CO-O-B.非共价键氢键R……H离子键R+……R-疏水作用RR范德华力RR3、肽链的分离、纯化与测定资料仅供参考,不当之处，请联系改正。共价键或非共价键的键能键长真空中水溶液共价键离子键氢键范德华力0.15nm0.25nm0.30nm0.35nm9080

40.190310.1kcal/mole资料仅供参考,不当之处，请联系改正。②.肽链的拆离方法A.二硫键的拆离过甲酸氧化法和巯基化合物（巯基乙醇）还原法。B.非共价键的拆离8M尿素或6M盐酸胍使蛋白质变性，多肽链松散而成

无规则的构象。C.烷基化试剂保护如碘乙酸保护还原-SH，防止重新氧化。3、肽链的分离、纯化与测定资料仅供参考,不当之处，请联系改正。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。4、肽链的部分水解拆链得到的多肽链一般是100-1000个氨基酸，需要将其切成小肽段，分别测定它们的顺序，

最后连在一起。1、裂解的部位要专一。2、裂解点要少，切的肽段的大小要合适。3、产率要高，要求试剂不能破坏裂解后的肽段。裂解的方法：化学法，酶学法资料仅供参考,不当之处，请联系改正。①、化学裂解法A.溴化氰裂法：专一裂解Met羧基所成的肽键4、肽链的

部分水解资料仅供参考,不当之处，请联系改正。甲基硫氰酸资料仅供参考,不当之处，请联系改正。①、化学裂解法B.羟胺断裂：专一裂解Asn-Gly之间的肽键。4、肽链的部分水解专一不很强，Asn-Leu,Asn-Ala键也部分裂解由于Asn-Gly出现机率较低，所以所得片断较大。资料仅供参考,不当之处

，请联系改正。②、酶裂解法A.胰蛋白酶(trypsin)4、肽链的部分水解专一裂解Lys、Arg的羧基参与形成的肽键。为了减少的作用位点，可用化学修饰将多肽链侧链保护起来，1.2－环己酮封闭Arg，马来酸酐封闭Lys。

氮丙啶形成带正电荷点，增加位点。B.糜蛋白酶(Chymotrypsin)断裂Phe,Trp,Tyr等疏水AA的羧基所形成的肽键。断裂键邻近的基团，碱性：裂解能力↑，酸性：裂解能力↓资料仅供参考,不当之处，请联系改正。NH2CHCH2COHOH2CH2CNHCNH2N+H2OONH2CHCH2COH

OH2CH2CNHCNHN+H环已二酮NH2CHCH2COHOSHH2CH2CNH++H+NH2CHCH2COHOSH2CH2CNH2资料仅供参考,不当之处，请联系改正。②、酶裂解法C.胃蛋白酶(Pepsin)4、肽链的部分水解断裂键

两侧的殘基都是疏水性或芳香氨基酸残基。其后和前为Pro时抑制。D.嗜热菌蛋白酶(Thermolysin)疏水、芳香氨基酸残基氨基端，含Ca，Zn。Phe,Trp,Tyr,Leu,Ile,Val,Met，羧基是Pro,Gly时

不作用。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。②、酶裂解法Ｅ.金黄色葡萄球菌蛋白酶（Glu蛋白酶），4、肽链的部分水解磷酸缓冲液PH7.8能在Glu殘基和Asn殘基的羧基侧断裂肽键，NH4HCO3缓冲液pH7.

8醋酸铵缓冲液PH4.0只能断裂Glu殘基的羧基侧肽键Ｆ.梭状芽孢杆菌蛋白酶（Arg蛋白酶）专门裂解Arg殘基的COOH所形成的肽键,对不溶性蛋白质的长时间裂解很有效。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。①胰蛋白酶Lys—X,Arg—X(X≠Pro)②胰凝乳蛋白酶Tyr—X

，Trp—X,Phe—X(X≠Pro)③胃蛋白酶Phe(Trp、Try、Leu)——Phe(Trp、Try、Leu)④嗜热菌蛋白酶X-Phe,Trp,Tyr,Leu,Ile,Val,Met（≠Pro）⑤Glu蛋白酶Glu——X⑥Arg蛋白酶Arg——X酶法裂解总结资料仅

供参考,不当之处，请联系改正。①电泳法：SDS-PAGE根据分子量大小分离②离子交换层析法:（DEAE-Cellulose、DEAE-Sephadex）根据肽段的电荷特性分离③反相HPLC法根据肽段的极性分离④凝胶过滤要求：SDS—PAGE单带HPLC单峰N端单一（常用DN

S－Cl法）5、肽段的分离纯化资料仅供参考,不当之处，请联系改正。1）、Edman法（1）耦联PITC＋H２N—A-B-C-D→pH9，40℃→PTC—A-B-C-D6、肽段序列测定及肽链的拼接资料仅供参考,不当之处，请联系改正。（2）裂解无水三氟乙酸（CF3COOH）→ATZ—A+H2N

—B-C-DCF3COOHATZ6、肽段序列测定及肽链的拼接资料仅供参考,不当之处，请联系改正。（3）转化（ATZ不稳定，转化成PTH-aa)ATZ→PTH—aaPTC肽：苯氨基硫甲酰肽;ATZ：噻唑啉酮苯胺（一氨基酸）;PT

H：苯乙内酰硫脲（一氨基酸）ATZNHNCHCRCSHOHOPTC-aaPTH-aaH2O(1MHCl)6、肽段序列测定及肽链的拼接资料仅供参考,不当之处，请联系改正。2）、用自动序列分析仪测序仪器原理：Edman法。1967液相测序仪：旋反应器，适于大肽段。1971固相测

序仪：表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦连肽段的Ｃ端。1981气相测序仪：用Polybrene反应器。6、肽段序列测定及肽链的拼接资料仅供参考,不当之处，请联系改正。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。3）、

肽段拼接成肽链16肽，Ｎ端HＣ端ＳＡ法裂解：ONSPSEOVERLAHOWT6、肽段序列测定及肽链的拼接Ｂ法裂解：SEOWTONVERLAPSHO重叠法确定序列：HOWTONSEOVERLAPS重叠法确定序列：HOWTONSEOVERL

APS重叠法确定序列：HOWTONSEOVERLAPS重叠法确定序列：HOWTONSEOVERLAPS资料仅供参考,不当之处，请联系改正。一条多肽链经两种部分水解的方法得到两套肽段，经测定各肽段的氨基酸顺序都已确定，推知整条肽链的氨

基酸顺序。1).溴化氰裂解后的肽段(1).Trp-Ser-Arg-Glu-Hsr(2).Gly-His-Ala-Leu-Lys-Phe-Glu(3).Ala-Gly-Val-Lys-Asp-Hsr(4).Pro-Val-Lys-Ile-Phe-Hsr2).胰蛋白酶裂解后

的肽段(1).Ile-Phe-Met-Trp-Ser-Arg(2).Ala-Gly-Val-Lys(3).Asp-Met-Pro-Val-Lys(4).Glu-Met-Gly-His-Ala-Leu-Lys(5).Phe-Glu(3)-(4)-(

1)-(2)(2)-(3)-(1)-(4)-(5)资料仅供参考,不当之处，请联系改正。根据以下实验结果,推断一条多肽链的氨基酸顺序.1).酸水解得知氨基酸的组成:2Ala;Arg;2Lys;Met;Phe;2Ser

.2).羧肽酶A水解得:Ala.3).胰蛋白酶水解得四肽段,其氨基酸组成如下:(1).Ala;Arg.(2).Lys;Phe;Ser.(3).Lys.(4).Ala;Met;Ser.4).溴化氰裂解得两个肽段,其氨基酸组成如下:(1).Ala;Arg;2Lys;Me

t;Phe;Ser.(2).Ala;Ser.5).嗜热菌蛋白酶水解得两个肽段,其氨基酸组成如下:(1).Ala;Arg;Ser.(2).Ala;2Lys;Met;Phe;Ser.Ala-Arg-Ser-Phe-Lys-Lys-Met-Ser-Ala资料仅供参考,不当之处

，请联系改正。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。测核酸序列→推断氨基酸序列1）酶降解法测序2）质谱法测定（蛋白质组）p177书3）根据核苷酸序列的推定法7、其它测序方法资料仅供参考,不当之处，请联系

改正。气质联用液质联用资料仅供参考,不当之处，请联系改正。对角线电泳法•胃蛋白酶酶解蛋白质；•第一向电泳；•过甲酸氧化—S—S—生成-SO3-后；•第二向电泳；•分离出含二硫键的两条短肽，测序•与拼接出的肽链比较，定出二硫键的

位置。8、二硫键位置的确定+-资料仅供参考,不当之处，请联系改正。（三）、多肽与蛋白质的人工合成氨基酸两个功能性基因(氨基与羧基)，在合成特定的肽键时就存在一问题，要求把另外的基团进行掩蔽，即相应基团的保护。1、基团的保护资料仅供参考,不当之处，请联系

改正。StrategyforMakingaSpecificPeptideBondNHCHCOOHR1NH2CHCR2Z(保护基)OY(保护基)+NHCHCR1NHCHCR2ZOYONH2CHCR1NHCHCOOHR2O缩合剂除去保护基

资料仅供参考,不当之处，请联系改正。氨基保护：苄氧酰基（CBZ）、叔丁氧甲酰基（BOC）、对甲苯磺酰基（Tosyl）。CH2OCOCCH3H3CCH3OCOSH3COO羧基保护：苄酯(OBzl)、叔丁酯

(Obut)（成盐、成酯）CH2OCCH3H3CCH3O资料仅供参考,不当之处，请联系改正。羧基活化：酰氯法（PCl5）、叠氮法、混合酸酐法、活化酯法。2、基团的活化在正常条件下，羧基和氨基之间形成的肽键是不会自发发生的，通常把羧基

活化。RCXOR1CXOHNHR2R1COHNR2HX+资料仅供参考,不当之处，请联系改正。缩合剂：DCC（二环己基碳二亚胺）直接接肽资料仅供参考,不当之处，请联系改正。资料仅供参考,不当之处，请联系改正

。支持介质：聚苯乙烯树脂合成方向：C端→N端。合成程序：右图3、多肽的固相合成断裂与去保护挂接去保护中和缩合