【文档说明】北大医学研究生课程-分子免疫学-细胞因子和细胞因子受体课件.ppt，共(134)页，12.051 MB，由小橙橙上传

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细胞因子和细胞因子受体CytokineandCytokineReceptor北京大学人类疾病基因研究中心王露细胞因子概念•细胞因子（Cytokine）是指由机体各种细胞分泌的具有调控细胞生长、分化、调节免疫功能和生理反应并参与病理反应的小分子蛋白质。细胞因子从细胞中释放出来成为重要的可溶性信

使蛋白，它是细胞间信号网络的组成部分。在免疫系统，这一网络调控天然免疫和特异性免疫应答中各种功能性事件，如炎症反应、防御病毒感染、特异性T、B细胞增殖及功能调节。细胞因子研究历史•1957年，发现干扰素（IFN）•1969年，提出淋巴因子（lymphokine）的概念•1974年，定名细胞因子（c

ytokine）•近年来，细胞因子发展迅猛，现已发现200多种细胞因子，成立专门的细胞因子学会，如国际细胞因子学会（internationalcytokinesociety）；创办研究细胞因子的专门杂志，如《Cytokine》等

。人类基因组研究显示，不仅有新成员存在于已有的细胞因子家族中，还会找到全新的家族，尚有多种细胞因子有待发现。怎样确定一种物质是细胞因子？•从人类基因组发现新细胞因子由于体内含量较高的细胞因子大部分已被克隆化

，传统的路线已经难以发现新免疫分子。目前的新细胞因子克隆化策略主要利用反向生物学原理，从人类基因组发现新细胞因子或其受体编码基因。传统生物学策略发现生物活性－鉴定细胞因子蛋白－克隆基因－细胞表型－动物模型－人体内功能及与疾病关联反向生物学策略数据库DNA序列－生物信息学－

蛋白质表达－细胞表型－动物模型－人体内功能及与疾病关联。•细胞因子序列同源性分析和基因Cluster分析[IL-19·20·23·27·30·33·35,IL-17B-F(包括IL-25)，IL-1F5-F10]•免疫细胞基因和蛋白表达谱分析（IL

-21·22·26·28A/B·29·31·32·34）•免疫相关疾病的易感基因或致病基因分析(IL-24)•利用免疫细胞筛选模型，开展基因表达文库或RNAi文库的功能筛选新的细胞因子的发现免疫细胞筛选技术生物信息学基因芯片酵母双杂交蛋白质组学结

构基因组学动物体内实验基因敲除转基因小鼠功能研究药物开发研究其它应用研究免疫细胞筛选技术在发现细胞分子研究的重要位置筛选潜在的细胞因子的策略•未知蛋白的生物信息学分析：–无功能性文章报道或无免疫相关的功能性报道–具有潜在的信号肽或被证实为分泌蛋白–蛋白氨基酸数目少于300个–主要在免

疫系统和造血系统中表达7获得的基因，ORF克隆连接在真核表达载体转染293T细胞，检测其分泌表达Th1Th2Th17TregCD4+CD45RA+naïveTcellsPBMCAnti-CD3,anti-CD28,IL-1b,IL-6,TNF-a,IL-

23,anti-IFN-γ,anti-IL-4Anti-CD3,anti-CD28,IL-12,IL-2,anti-IL-4Anti-CD3,anti-CD28,IL-4,IL-2,anti-IFN-γ,anti-IL-10Anti-CD3,anti-CD28,IL-2,TG

F-βIFN-γT-betIL4,IL-5,IL-13GATA-3IL-17A,IL-17F,IL-22,IL-26RORγtCD25FoxP3DifferentiationindexProliferationindexApopt

osisindex[3H]Thymidineincorporationassay、BrdU、CFSEAnnexinVExpressionprofileofnovelgeneAddthesecretedprotein在免疫细胞中，检测其生物学功能•正常细胞：

–未活化时，产生很少；–活化后，产量可提高成百上千倍；如活化的淋巴细胞、活化的单核/巨噬细胞、NK细胞、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞等。IL-1、IL-6、IL-12、IL-18和TNF—主要由巨噬细胞产生的细胞因子细胞因子的来源•肿瘤细胞–如Jurkat细胞(IL-2

,3)、骨髓瘤细胞(IL-6)、WEHI-3(IL-3)等。•基因工程技术–从工程细胞如大肠杆菌、酵母菌等产生重组细胞因子。细胞因子的分类根据产生细胞因子的细胞种类分类：1、淋巴因子(lymphokines)2、单核因子(m

onokines)3、非淋巴因子、非单核因子/巨噬细胞产生的细胞因子：基质、血管内皮、成纤维细胞等根据细胞因子的结构和功能分类1、白细胞介素(Interleukin,IL)2、集落刺激因子(Colony-StimulatingFactor,CSF)3、干扰素(Int

erferon,IFN)4、肿瘤坏死因子(Tumor-NecrosisFactor,TNF)5、趋化因子(Chemokine,CK)6、生长因子(GrowthFactor,GF)7、转化生长因子家族（TGF-b)1.白细胞介素(Interleukin,IL)1979年第

二届国际淋巴因子专题讨论会上命名的，将由白细胞产生的又在白细胞之间发挥作用的细胞因子统一命名为白细胞介素，正式命名的有IL-1--IL-35。Interleukin来自inter-leukin，意指白细胞之间信使分子，中文译为白细

胞介素。白细胞介素的分类•IL-1家族：IL-1α/β·1Ra·18·33•IL-2家族：IL-2·4·7·9·15·21(共用γ受体链)•IL-6家族IL-6·11·27·30·31(共用gp130受体链)•IL-10家族IL-10·19·20·22·24·26·28A/B·2

9(结构相似)•IL-12家族IL-12·23·27·35(均为异源二聚体结构)•IL-17家族：IL-17A、B、C、D、E和F[1]。•集落刺激因子IL-3·1·5·6·11•IL-8（趋化因子）•其它IL：IL-13·14·16·

32·34传统生物学策略生物活性蛋白质基因细胞动物模型人体内功能及与疾病关联分离纯化cDNA克隆检测表型构建临床相关反向生物学策略DNA蛋白质细胞动物模型人体内功能及与疾病关联检测表型构建临床相关疾病标本DNA致病基因或易感基因分析IL-2•1976发现,1979年命名,1983年克隆成功•

1965年发现混合白细胞培养上清中存在一种可溶性因子，可促进细胞生长，命名为母细胞形成因子（BlastogenicFactor，BF)•1976年发现小鼠脾细胞培养上清中含有一种刺激胸腺细胞生长的因子，故称为T细胞生长因子（Tcellgrowthfactor，TCGF）•1979

年统一命名为白细胞介素2（interleukin2，IL-2）•IL-2别名–BF(blastogenicfactor);Costimulator;EDF(eosinophildifferentiation

factor);KHF(killercellhelperfactor);LMF(lymphocytemitogenicfactor);LCMfactor(lymphocyte-conditionedmediumfactor)LPF(lymphocyteprolifera

tionfactor);MAF-CI(macrophage-activatingfactorforcytotoxicityI);PFC-EA(plaqueformingcellenhancingfactor);SC

IF(secondarycytotoxicT-cellinducingfactor);TCGF(T-cellgrowthfactor);TCPA(Tcolony-promotingactivity);TDF(thymocyt

edifferentiationfactor);TMF(thymocytemitogenicfactor);TMF(T-cellmaturationfactor);TMF(T-cellmitogenicfactor);TR

F-3(T-cellreplacingfactor-3);TSF(thymocytestimulatingfactor).•1983年Taniguchi从ConA刺激的Jurkat白血病T细胞中克隆成功–IL-2含有133aa，分子量为15.5kDa–N端有糖基化修饰–三个半胱氨酸：58、105、

125位•IL-2主要产生细胞：–主要由活化CD4+Th1分泌,CD8+T和NK也能产生–T细胞肿瘤细胞系:如人Jurkat和小鼠EL-4–T淋巴细胞杂交瘤:FS6-14.13、HT-24A等•IL-2受体：CD25(α)；CDl22(β)；CDl32(γc)IL-2的生物学活性•作用具有沿

种系谱向上有约束性，向下无约束性：1、促进活化的T细胞进入S期，维持细胞的增殖，刺激产生：MHCII，IFN-γ，IL-4、5、6，LT-α，CSF。2、促进杀伤细胞分化和效应：CTL，NK，LAK；诱导杀伤细胞：IFN-γ，TNF-α

产生，增强CTL穿孔素表达3、直接、间接作用于B细胞：促进增殖分化，Ig分泌4、促进巨噬细胞通过ADCC机制杀伤肿瘤IL-2主要生物学活性•白细胞介素2超家族:oneimportantfamilyoftypeIcytokinesisthecommoncytokinereceptorγ

-chain(γc)family,whichconsistsofIL-2,IL-4,IL-7,IL-9,IL-15andIL-21,andissonamedbecausethereceptorsforthesecytokinesshareγc(alsoknownasIL-2RγandCD132

)YrinaRochmanetal.NatureImmunology.2009.9：480-4902.集落刺激因子(Colony-StimulatingFactor,CSF)•能够刺激多能造血干细胞和不同发育阶段的造血祖细胞增殖分化，并在半

固体培养基中形成相应细胞集落的细胞因子。•根据刺激不同造血细胞系或不同分化阶段的细胞有不同的命名G-CSF(粒细胞集落刺激因子)•1983年命名,1986年克隆成功.•人G-CSF基因位于17号染色体,•人类有两种不同的G-CSFDNA,

分别编码含207和204个氨基酸的前体蛋白,均有30个氨基酸的先导序列,除了在35位插入了3个氨基酸外,其余序列相同.•有5个半胱氨酸36=42,64=74,17游离.•来源•多种细胞可产生–内毒素、T

NF-α、IL-1、IFN-γ活化单核/巨噬细胞可产生，–刺激成纤维、内皮细胞也可产生，–某些肿瘤细胞可产生生物学活性•主要作用于中性粒细胞谱系造血细胞的增殖、分化和活化•对人粒细胞、单核细胞、成纤维、平滑

肌细胞等有趋化作用。G-CSF与临床1、粒细胞减少症2、肿瘤化疗引起血细胞减少症3、贫血和骨髓发育异常综合症3.干扰素(Interferon,IFN)•具有干扰病毒感染和复制功能的细胞因子。•1957年从病毒

感染细胞培养中分离到一种生物活性物质，因它可以干扰其它病毒的复制而被命名为干扰素。干扰素的命名•20世纪60年代根据来源及对酸的耐受程度，将干扰素分成I和II型；–I型(IFN-α，IFN-β)耐酸，pH2活性稳定，其中白细胞产生的称白细胞干扰素，成纤维细胞产生的称成纤维干扰素；–II型(IF

N-γ)不耐酸，是抗原或有丝分裂原刺激PBMC产生又叫免疫干扰素；•80年代又将其称为IFN-α，IFN-β，IFN-γ；•IFN-α是异质性的，包括14个亚型，编码基因成串排列在9p23，产物高度同源。•IFN-α、IFN-β均定位9号染色体，单外显子；•许多刺激剂可活化基因表

达；•IFN-α、IFN-β分子结构有相似之处；•成熟的IFN-α各亚型有166个氨基酸(IFN-α2165个),高度同源,4个保守的半胱氨酸。•成熟的IFN-β有166个氨基酸,3个半胱氨酸•成熟的IFN-γ由143个氨基酸组成，以同

源双体形式存在，对酸不稳定。生物学活性IFN-α和IFN-β1、抗病毒活性：诱导抗病毒蛋白：▪2-5A合成酶--催化寡核苷酸PPP--活化RNaseL--降解病毒RNA；▪蛋白激酶PKR--肽起始因子eIF2磷酸化而灭活，抑制病毒蛋白的合成。2、抗细胞增殖：与抗病毒蛋白合

成的机制相似;3、免疫调节：上调巨噬细胞IgGFc受体促进ADCC；活化NK，促进杀伤；•诱导MHCI、II类分子表达，增强免疫应答水平。有抗病毒、抗肿瘤的活性，但免疫调节的作用比IFN-α/β重要的多，有较严格的种属特异性。•IFN-γ1、上调MH

CI类、II类分子的表达；2、促进Th1细胞分化；3、激活NK、巨噬细胞；4、抑制Th2细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。病毒病毒复制抑制病毒复制信号转导IFN-aIFN-诱导蛋白诱导刺激胞核胞核I型干扰素α：抗病毒10–12g干扰素能在培养组织中保护一百

万个细胞免受一千万个病毒颗粒的感染4.肿瘤坏死因子(Tumornecrosisfactor,TNF)•1975年发现的一种能使肿瘤发生出血坏死的物质，该因子对多种肿瘤细胞系具有细胞毒作用，而且在多种动

物模型中可引起肿瘤坏死，将其命名为肿瘤坏死因子（TumorNecrosisFactor，TNF）。•1984,TNFa的cDNA得以克隆，后来相继克隆了该家族的多个成员，构成了TNF超家族细胞因子。TNF超家族特征•绝大多数成员为II型膜蛋白；在特异性金属蛋

白酶作用下，形成可溶形式•活性形式多为同源三聚体；•TNF超家族包括TNFa,,TRAIL,FASL等；此外，尚有一批与TNFa序列同源，但缺乏诱导凋亡活性的TNF家族成员。–TNF-α:巨噬细胞产生；–TNF-β:又称为淋巴毒素α(lymphotoxin-α，LT-α），主要由活化T细胞产生；

–TNF-α和TNF-β共用受体，功能相似。骨髓MjT细胞B细胞巨噬细胞中性粒细胞IL-2IL-4g-IFNTNF-a上调细胞因子产生水平（IL-2，IL-4，g-IFN，CSF）上调IL-2受体的表达

诱导分化上调抗体产生数量上调前列腺素产生水平上调细胞因子产生水平（IL-1，IL-6，IL-8，GM-CSF）趋化并活化中性粒细胞体内刺激产生CSF上调造血功能TNF-a对淋巴组织的作用TNF-α功能广泛:为炎性因子，引起发热、诱导急性期蛋白合成、介导内毒素性休克可诱导凋亡5.趋化因子(C

hemokine,CK)•是能使细胞发生趋化运动的小分子细胞因子。主要功能是招募血液中的单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等进入感染部位,参与免疫调节和免疫病理反应，包括CXC,CC,C,CX3C亚家族•趋化运动是指细胞向高浓度刺激物方向的定向运动。根据蛋白质一级结构进行分类：CXC

,CC,C,CX3C亚家族主要功能1、趋化作用；2、上调整合素的表达，活化白细胞；3、促进细胞脱颗粒和生物活性物质释放；4、调节血管生成；5、调控免疫细胞分化、发育、成熟，在周围免疫器官正确定位、相互作用，并回到相应组织发挥生物学作用。6.生长因子(Growthfactor)•具有促进不同类型细胞

生长效应的细胞因子，如TGF-β、FGF、EGF、VEGF、NGF、PDGF等。•VEGF(VEGF-A),•VEGF-B,•VEGF-C,•VEGF-D,•PlGF(placentalgrowthfactor).•TheVEGFfamilyofreceptors

consistsofthreeprotein-tyrosinekinases(VEGFR1,VEGFR2,andVEGFR3)andtwonon-proteinkinaseco-receptors(neuropilin-1andneuropilin-2).•Thesecomponentspar

ticipateinnewbloodvesselformationfromangioblasts(vasculogenesis)andnewbloodvesselformationfrompre-existingvasculature(angiogenesis)

.InteractionbetweenVEGFR1andVEGFR2orVEGFR2andVEGFR3altersreceptortyrosinephosphorylation.血管内皮生长因子(VE

GF)•ThegeneencodinghumanVEGFconsistsofeight•exonsseparatedbysevenintrons•Thefirst26a.a.inVEGFconstitutethesignalingpeptideshowingthat

•VEGFisasecretedprotein.•AlternativesplicingoftheVEGFgeneproducesfourdifferentisoforms—VEGF121,•VEGF165,•VEGF189,•VEGF206•VEGF145andV

EGF183•InVEGFsecretingcells,themostfrequentisoformisVEGF165,a•homodimerwithmolecularmass45kDthereisamechanismthatenablesselectionofjustsomeendotheli

alcellsinsidethecapillarytoinitiateangiogenicexpansion.Thesecellscalled“tip-cells”occupytheleadingpositionwhilenewvesselsg

row:theyreacttotheVEGFAgradientthatspecifiesthedirectionoftheirmigrationandmoveforwardofthegrowingcapillary.Angiogenicstimuluscausesm

ajorchangeinthetip-cellphenotype.Theyacquiresuchpropertiesasinvasivenessandtheabilitytomigrate.Theyalsoactiv

atesecretedorcellsurfaceproteasesforpartialdestructionofadjacentbasementmembrane.7、转化生长因子（TGF-β）•TGF-β超家族是一组调节细胞生长和分化的蛋白质家

族,这个家族至少有25个成员，除了TGF-β外还有活化素，抑制素，骨形成蛋白，胶质细胞源性神经营养因子家族等•TGF-β的命名是根据这种细胞因子能使正常的成纤维细胞的表型发生转化,即从贴壁→琼脂中生长。•分

子结构和编码基因•1985年克隆成功,哺乳动物有:TGF-β1,TGF-β2,TGF-β3,TGF-β4四个亚型,前三种为同源二聚体分子Pre-pro-TGF-βPre-pro-TGF-βNpro-TGF-βTGF-β(有活性)TGF-β的产生1、机体多种细胞都可分泌非活性状态的TGF-β。

2、活化的淋巴细胞TGF-β水平增高。3、几乎所有肿瘤细胞均可检测到TGF-βmRNA。生物学活性1、抑制细胞增殖：对大多数细胞的增殖具有抑制作用，因此TGF-β具有形态发生、免疫抑制和肿瘤抑制的作用。2、它在肿瘤的转移中又可

以发挥促进作用，特别是在EMT中发挥了重要作用。3、对细胞表型的调节：抑制IL-2诱导T细胞表达IL2R，TfR等，抑制IFNγ诱导黑色素细胞表达MHCII抗原4、促进Treg,Th17细胞的增殖分化。、抑制细胞因子的产生：如TNFα/β，IFNγ，IL-4，IL-12上皮

间质变迁（epithelial-mesenchymaltransition,EMT）EMT是细胞转分化的一种方式。特点：上皮细胞的极性消失--细胞与细胞之间的连接丧失；细胞骨架和细胞器的分布状态发生改变等；

细胞表达间质细胞特有的某些分子如波形蛋白（vimentin),上皮细胞的标志分子如E-cadherin则消失;细胞出现迁移和运动能力。EMT的核心过程是细胞极性模式的变迁--上皮细胞的稳定极性模式消失，代之以间质细胞的动态极性模式。

上皮间质变迁与癌细胞演变癌症的传统定义是上皮组织的恶性细胞病变。起源于上皮组织的癌细胞从原发上皮细胞的稳定极性模式演变为少数具有迁移能力的细胞才具有的动态极性模式，从而获得了侵袭和转移的能力，此即癌细胞演进的EMT学说。与EMT相关分子•许多抑癌基因的功能丧失性突变或表达

下调与EMT有关,如：APC,CDH1,β-catenin，PTEN等,•许多生长因子参与了EMT,如EGF,TGFβ,HGF,FGF等，特别是TGFβ在EMT中起到了重要作用，在多条通路中都发挥作用vectorAKT/ΔAKTTransientad-V4Day＋St

ableSylviaJulienGrilleetal.,“TheProteinKinaseAktInducesEpithelialMesenchymalTransitionandPromotesEnhancedMotilityandInv

asivenessofSquamousCellCarcinomaLines,”CancerRes63,no.9(May1,2003):2172-2178.一个新的抑制EMT细胞因子的发现PartⅡ.E-Cadherinredistr

ibution&down-regulationSylviaJulienGrilleetal.,“TheProteinKinaseAktInducesEpithelialMesenchymalTransitionandPromotesEnhancedMot

ilityandInvasivenessofSquamousCellCarcinomaLines,”CancerRes63,no.9(May1,2003):2172-2178.AKTSTABLEshRNA

A549稳转株迁移能力显著增强Cltr.BCltr.CCltr.Esh3.Ash3.Csh3.E0H24H36H0H24H36H细胞因子受体细胞因子发挥广泛多样的生物学功能是通过与靶细胞膜表面的受体相结合并将信号传递到细胞内部。因此，了解细胞因子受体的结构和功能对于深入研究

细胞因子的生物学功能是必不可少的。从细胞因子结合其受体开始，到某些基因转录的启动，要经历复杂的细胞内分子间的相互作用，这样的作用过程称为细胞因子的信号转导；细胞因子受体都是跨膜蛋白，由胞膜外区、跨膜区和

胞浆区组成。CCCCC1C3C2C1C3C2C1C3C2C1C3C2G蛋白I类细胞因子受体II类细胞因子受体TNF-R趋化因子受体1.I型细胞因子受体家族：（造血因子受体家族）2.Ⅱ型细胞因子受体家族：（干扰素受体家族）3.Ⅲ型细胞因子受体

家族：（肿瘤坏死因子受体家族）4.趋化性细胞因子受体（CKR）家族：1.造血细胞因子受体超家族（I类）•结构特征：是细胞因子受体中最大的一个家族，多数成员属于多亚单位受体，其中一种或两种亚单位多肽负责

结合细胞因子•膜外区序列结构相似于EpoR,即膜外N端含4个高度保守Cys,近膜侧含1个Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser(WSXWS)的基序D2002.IFN受体家族(II类细胞因子受体家族)•结构特征：两条肽链组成，胞外区

Fn3样结构域由200个氨基酸残基组成，也称D200，并含有4个不连续的半胱氨酸，包括IFN和IL-10受体7个aa22个aaIL-10TNFaTNFCD40LNervegrowthfactor(NGF

)FASL3.TNFR超家族•主要包括：TNF、Fas、CD40、神经生长因子受体等•结构特征：这类受体富含半胱氨酸，在与细胞因子结合后三聚体化。胞外区有3-5个由40个氨基酸残基组成的重复亚单位；每个重复亚单位含有4-6个保守的半胱氨酸；形成“

配体结合区域。•TNFRI（P55，CD120a）：胞内同源序列即“死亡结构域”•TNFRII（P75，CD120b）不含死亡结构域L肿瘤坏死因子受体可发挥免疫调节作用•肿瘤坏死因子受体家族的CD40和FAS具有重要的免疫调节作用:–CD40---

---------B细胞，巨噬细胞–CD40L，FASL---效应T细胞–CD40L+B细胞CD40—B细胞增生，Ig类别转换–CD40L+巨噬细胞CD40---巨噬细胞分泌TNF–FAS+FASL----表达FASL的CTL可清除表达FAS的淋巴细胞，这是一种重要的免疫应答的负反馈

调节机制。4.趋化因子受体超家族•结构特征：是G蛋白偶联受体G-bindingproteincoupledreceptor,G-PCR)。由7个疏水性的跨膜区组成，又称7个穿膜区受体超家族。和相应的配体结合后，经偶联GTP结合蛋白而发挥生物学效应•CKR分类1、根据结合配体的不同，分为CXCR，

CCR，XCR,CX3CR；2、根据特异性不同，分为特异性受体、共享性受体、杂合性受体（DARC：Duffy血型抗原，红细胞趋化因子受体）、孤儿受体、病毒受体等。CXCR4和CCR5是HIV感染的共受体(Coreceptors)HIV-1病毒嗜细胞特性与HIV有关的趋

化因子受体还有CCR2,CX(3)CR1等。（二）细胞因子受体的几个特点1.细胞因子受体共同链•两个或更多细胞因子受体亚单位组成异聚或多聚体形式，包括一特异性配体结合（a链，低亲和力受体）和一个参与信号转导链（链，参与高亲和力受体形成和信号转导）。gC高亲和力IL-2受体gg

aa低亲和力IL-2受体中等亲和力IL-2受体IL-2IL-2受体IL-2RIL-4RIL-7RIL-9RIL-15RIL-21Rg-链参与组成的细胞因子受体共用的g链gC突变导致T细胞发育障碍Cytokinerec

eptorsthatsharegCsubunitandtheirfunctions.gp130参与造血因子受体家族高亲和力受体形成和信号转导，不直接参与配体结合细胞因子受体共用链的意义•节约；•细胞因子功能替代；•共用链缺失或功能缺陷，将引起严重后果，如IL-2R亚家族

的g链缺陷，将引起SCID。2.可溶性细胞因子受体(sCKR)•产生方式：–大部分为膜受体脱落，如SIL-1R、SIL-2R、sTNFR、sIFNrR、sGM-CSFR、sIL-5R、sIL-6R等–小部分为分泌型，如sIL-4R、sG-CSFR、sIL-5R、sIL-6R•生物

学活性：–膜受体正常代谢途径–膜受体相应配体“竞争抑制剂”•应用：–检测，治疗sCKR与临床：•检测：–sIL-2R：恶性肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染与其他传染性疾病、移植排斥反应等–sIL-6R：炎症与自身免疫性疾病、感染性疾病、肿瘤和白血病等–sTNFR：炎症与自身免疫性疾病、感染性

疾病、肿瘤和白血病、骨髓移植等•治疗：•大多数sCKR与细胞因子结合后阻断细胞因子与膜受体结合，从而抑制细胞因子的生物学活性。应用sCKR为减轻或防止细胞因子造成的病理损害提供了新的治疗途经。3.细胞因子受体有天然拮抗剂•

IL-1受体拮抗剂•病毒产生的细胞因子结合蛋白，TNF，IL1细胞因子受体的信号转导•细胞因子受体的信号转导主要利用2个信号转导途径：–JAK(Januskinase)-STAT–Ras－MAPK激酶途径细胞因子介导的信号转导Cytokineinducedsignal

transduction细胞因子结构与功能特点•结构：同源性低，小分子蛋白，多为单链，少为双链、三聚体（TNF）、多含糖基•量微而活性强（pmol/L）细胞因子作用是作为细胞之间的信使细胞因子作用特点：•旁分泌或自分泌，瞬时、距离范围小•通过与相应受体结合

发挥作用•细胞因子诱导的受体亚单位聚合可以活化蛋白酪氨酸激酶(JAK),导致转录因子STAT酪氨酸磷酸化而激活靶基因转录•多效性、重叠性、拮抗性、协同性、网络性：生理调节、病理反应89细胞因子间可相互诱生：IL-1能诱生IFN、IL-1、IL-2、IL-4等，IL-2能诱生TNF、I

L-2、LT等。细胞因子可调节细胞因子受体的表达：IL-1、IL-5、IL-6等可促进IL-2受体的表达；IL-1能降低TNF受体的密度，细胞因子与生物活性之间的相互影响。B细胞和T细胞活化过程中，常需要两种以上

细胞因子的协同作用或彼此调节。自分泌内分泌远距离作用旁分泌作用于比邻细胞作用于分泌细胞自身细胞因子分泌的方式血液循环多效性重叠性（丰裕性）拮抗性协同性TH1Mj骨髓基质细胞IL-1IL-6IL-7SCF造血干细胞IL-1IL-6IL-11TNF-aGM-CSFG-CMFM-CSF单核细胞TH

2B中性粒细胞嗜酸性粒细胞IL-4IL-5IL-6IL-13IL-10TGF-IL-4IL-4内皮细胞IL-4TcIL-2IFN-gIL-10IL-13IL-4NK1+TNK细胞IFN-gIL-2IL-2内皮细胞纤维母细胞下丘脑IL-1IL-6TNF-aIL-4IL-6IL-4细胞

因子的作用具有网络性主要生物学效应•抗感染（细菌和病毒）•肿瘤()•刺激造血细胞增埴分化•免疫细胞的分化•免疫调节作用•细胞因子佐剂•其它：促进血管生成，参与炎症反应、各种细胞的生长和分化参与免疫应答与免疫调节免疫应答识别（感应）阶段IFN-g

刺激APCMHC-II的表达IL-10抑制抗原递呈免疫应答细胞扩增阶段IL-2、IL-4、IL-5、IL-6等促进T、B细胞的增殖与分化TGF-抑制淋巴细胞增殖免疫应答效应阶段趋化因子吸引炎症细胞TNF-a、IL-1、

IFN-g、GM-CSF等激活巨噬细胞，增强吞噬杀伤活性TNF-a、TNF-具有细胞毒性并刺激中性粒细胞IFN-g抑制病毒复制在免疫应答过程中，免疫细胞之间通过细胞因子相互刺激、彼此约束，对免疫应答进行调节，维持免疫系统的稳态平衡细胞因子与疾病•细胞因子及受体缺陷•细胞因

子过高表达•可溶性受体水平升高细胞因子的检测•用于判断机体免疫功能，进行疾病辅助诊断，判断病程，预后，评价治疗效果细胞因子检测常用方法•生物活性检测法(biossay)--检测细胞因子的生物学活性•免疫学检测法(immnuossay)

--检测细胞因子蛋白质的抗原特性•分子生物学检测法-检测细胞因子的mRNA表达生物活性检测法•增殖实验：应用某一细胞因子能特异刺激或抑制某些指示细胞的增殖,通过[3H]TdR摄入,MTT,反应待测细胞因子的活性水平;•集落形成实验：半固体培养系统,造血因子集落刺

激因子诱导干细胞形成某一或某些种类的集落.•直接杀伤靶细胞：[3H]TdR、51Cr释放法•抗病毒活性：干扰素抑制病毒致病变的程度,计算样品中IFN的活性单位•凋亡实验：各种试剂盒、流式细胞仪•趋化实验：琼脂糖中的趋化实验、微孔小室趋化

实验•迁移、侵袭实验：划痕试验、transwell细胞增殖常用方法3H-thymidineincoroperation法将PBMC2×106/ml置於96-wellplate,再加入RPMI培养基或添加有LPS(li

popolysaccharide),ConA,PHA,PWM等细胞丝裂原的培基。於37℃CO2培养箱2天後，加入1μCi/well3H-胸腺嘧啶（thymidine），继续培养8小时后，以cellharvester收集细胞于滤纸上，风干后以

闪烁计数仪测3H-thymidine含量，计算细胞增殖能力。MTT法基本可以替代。•CellCountingKit-8简称CCK-8试剂盒，是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，

可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan(参考图1)。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。•Transwell•将Transwell小室放

入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层

培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。•肿瘤细胞迁移实验8.0、12.0µm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。•肿瘤细胞侵袭实验•8.0、12.0µm膜，原理与肿瘤细

胞迁移实验类似。•transwell侵袭实验，原理简单地说就是用一层膜将高营养的培养液和低营养的培养液隔开，细胞放在低营养的培养液里，为了找吃的，细胞会往高营养的培养液里面跑，但是有膜挡着，所以要穿过膜才行。我们在膜上涂上一层基质胶，模仿细胞外基质，于是细胞要把基质消化了才可以从低营养的培养液跑到

高营养的培养液里面，最后我们检测高营养的培养液里细胞量就可以知道细胞的侵袭能力了。免疫学检测法(1)•可溶性细胞因子检测:–放射免疫测定（RIA）特异Ab包被+待测样品和同位素标记的细胞因子-竟争抑制实验–酶联免疫吸附实验（ELISA）双抗体加心法–Western

Blot–检测单个细胞分泌的细胞因子：细胞斑点、酶联斑点免疫学检测法(2)•细胞内和细胞膜上的细胞因子的研究–检测单个细胞结合的细胞因子：生物素、碱性磷酸酶、免疫荧光–检测细胞内的细胞因子细胞内的细胞因子的荧光检测分子生物学检测•Sou

thernBlot•NorthernBlot•原位杂交•RT-PCR体内功能研究•基因敲除、转基因•利用特异性抗体观察细胞因子在体内的生物学作用细胞因子的应用•在临床治疗：•补充和添加–抗肿瘤细胞因子：IL-2、IFNa–促进

造血的细胞因子：G-CSF、GM-CSF、EPO、IL-11•阻断和拮抗–IL-1RA，TNF单抗，可溶性TNFR生物佐剂：增强抗原性细胞因子的临床应用举例1、重组细胞因子：IFN-α治疗肝炎；GM-CSF,G-CSF治疗白细胞减少。2、细胞因子抑制剂：（1）可溶性细胞因子受体,可

溶性TNF-α受体治疗RA类风湿性关节炎(RA)；（2）细胞因子抑制物,IL-1受体拮抗剂（IL-1ra）治疗类风湿关节炎（3）抗细胞因子或细胞因子受体抗体，抗TNF-α治疗RA。3.免疫毒素：DAB389-IL-2免疫毒素治疗T细胞淋巴瘤

已批准上市的重组细胞因子药物IFNα白血病、Kaposi肉瘤、肝炎、癌症、AIDSIFNγ慢性肉芽肿、生殖器疣、过敏性皮炎、类风湿关节炎G-CSF自身骨髓移植、化疗导致的粒细胞减少症、再生障碍性贫血GM-CSF自身骨髓移植、化疗导致的血细胞减少症、再生障碍性贫血

Epo慢性肾衰导致贫血、癌症或癌症化疗导致的贫血、失血后贫血IL-2癌症、免疫缺陷、疫苗佐剂IFNβ多发性硬化症IL-11放化疗所致血小板减少症SCF与G-CSF联合应用与外周血干细胞移植EGF外用药治疗烧伤、溃疡bFGF外用药治疗烧伤、外周神经炎FDA批准上市的细胞因子抑制剂•美国FDA

2001年11月批准上市的IL-1ra（Kineret），治疗类风湿关节炎治疗：炎症和自身免疫病；T细胞淋巴瘤、白血病；移植排斥等白喉毒素片段（389aa）IL-2治疗T细胞淋巴瘤的细胞因子免疫毒素DAB389-IL2结

构示意图我国已批准进入临床的基因治疗项目：P53腺病毒治疗肿瘤（批准上市）IX因子基因治疗血友病缺失突变腺病毒（H101）治疗肿瘤VEGF裸DNA治疗梗塞性外周血管病TK基因治疗恶性脑胶质瘤IL-2基因瘤苗治疗胃癌XSCID的IL-2受体g链基因治疗

（2000年法国报道2例，迄今11例，10例成功）。但2002年发现2例出现白血病,基因均整合至癌基因LMO-2。YrinaRochmanetal.NatureImmunology.2009.9Bubble-boy(IL-2R的γ链缺陷引起SCID)XSCID基因治疗原理表达细胞因子

VEGF的腺病毒或裸DNA直接体内注射治疗梗塞性血管病细胞因子佐剂细胞因子在免疫应答的产生和调节中具有重要作用，可作为免疫佐剂增强疫苗的免疫效果。近年来，重组质粒表达的细胞因子在核酸疫苗研究领域引起了人们广泛的兴趣与关注。核酸疫苗通常比复制性完整的病原体的免疫原性差，需要多次免疫

才能使动物得到有效保护。为了提高这类疫苗的效率，人们尝试了许多方法。正如传统疫苗可通过添加佐剂来增加其免疫作用一样，基因工程疫苗也可通过添加佐剂来达到增强免疫作用的目的。人们最感兴趣之一的便是细胞因子。•1增强细胞免疫反应的细胞因子•IFN-γ，IL-2，IL-12，IL-15或IL

-18会降低IgGl/IgG2的比例，显示Thl倾向性，同时加强迟发型超敏反应（delayedtypehypersensitivity,DTH）和升高CTL反应。•2增强体液免疫反应的细胞因子•IL-4、IL-6和IL-10与在

抗HIV、HBV、HSV核酸疫苗联合应用后，均会降低IgG1/IgG2抗体比例，提高DTH水平，加强CTL应答。•3同时增强细胞免疫和体液免疫反应的细胞因子•GM-CSF是另外一种新型的免疫佐剂，能诱导分化、增殖和活化

多种免疫活性细胞，它不仅可以刺激巨噬细胞的生成，还可以诱导体液免疫和细胞免疫。•IL-2的功能比较广泛，对T细胞和B细胞，NK、巨噬细胞等都有作用，因此IL-2可通过不同作用环节调节和增强DNA免疫效应，发挥佐剂作用。思考题1.试举例说明

细胞因子在临床的应用（2个以上细胞因子）。2.试述细胞因子的结构与功能特点。134以上有不当之处，请大家给与批评指正，谢谢大家！