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2023/4/1四类药型评价◼利用计算机辅助药物设计系统得到的化合物，除了在化学上要求易于合成以外，还应该关注溶解性、代谢稳定性和安全性性质，即设计的药物应具有优良的ADME（吸收、分布、代谢、排泄等）特性，这些性质与药物和“类药性”分子的要求一

致。◼类药性（drug-likeproperty）代表了理想化药物所具有的特点，是药物所表现出来的理化性质和结构特征在体内的综合反映(包括药动学性质和毒性)。简单来讲就是和已知的药物分子所具有的相似性。◼一般认为化合物所表现出的结构和理化性质应与体内药动学参数具有良

好的相关性，并能够满足该化合物口服途径，获得理想的吸收、分布、代谢和排泄要求。此外还应该具有易合成性和市场可接受性等特点。2023/4/11PARTONE前言请在此处添加具体内容，文字尽量言简意赅，见到那描述即可，

不必过于繁琐，注意版面美观度。22023/4/1类药性的判断方法◼排除法◼模版法◼直接性质预测法2023/4/132023/4/11、排除法◼所谓的排除法就是参考已知的经验，排除那些可能导致毒性、生物利用度低下或者其它不适宜作为药物的性质。⑴利平斯基规则⑵已知不合适

官能团排除法⑶其它法则2023/4/142023/4/1⑴利平斯基规则◼利平斯基（Lipinsk）规则，又称Ro5规则，是一个被广泛认知和接受的类药性过滤方法，也有人称其为类药性5规则。该规则是考虑到要使设计的化合物具有较好的生物利用度，药物分子必须能够穿透细胞膜，因此以分子是否具有良好的膜

渗透性来作为过滤的条件。◼Ro5规则认为，一个化合物如果违背了下述规则中的任意两条，就很难被生物体所吸收：①分子量小于500；②氢键给体（OH或NH）小于或等于5；③氢键受体小于10；④logP小于5。2023/4/152023/4/1⑵已知不合适官能

团排除法◼某些具有潜在诱变性和致癌性的官能团，如在第二章谈到的毒性基团，或者在代谢过程中不稳定易产生毒性的基团一般被认为不具有类药性，而应该严格控制。◼另外，具有活性官能团的化合物，可以与蛋白质作用，在体外产生假阳性或毒性，不再具有类药性而应该尽可能的避免。这种筛

选方法不需要特殊的计算法则，只需要根据普通的医药化学知识和个人的经验确定。2023/4/162023/4/1⑶其它法则◼又很多相应的规则，如：◼药物的物理性质的类药分子通用规则①分子量在160~480之间，平均为357；②logP在-0.4~5.6之间，平均2.52

；③摩尔折射率40~130之间，平均97；④原子数在20~70之间，平均48；⑤分子中必须同时具有以下几种官能团中一部分：苯环、杂环、脂肪胺（最好是叔胺）、羧基、酰胺、醇羟基、羧酸酯、酮基等。2023/4/172023/4/1◼基于PSA的类药性规则该规则考虑了分子的柔性，要得到具有大于2

0%~40%的生物利用度，化合物分子必须满足：①PSA小于或等于140Å2（或者氢键供体和氢键受体数小于或等于12），该条件与极化基团渗透细胞膜的去溶剂化能有关；②可旋转的化学键小于或等于10，◼PSA（极化表面积—极化原子的范德华表面积之和）是与膜渗透相关的另一个参数，研究表明

，口服吸收的PSA上限为140~150Å2，穿透血脑屏障的PSA不超过90Å2，2023/4/182023/4/1◼药效团类药性法则：①一个类药性分子起码有两个以上的药效点，但也不能多于7个；②基本药效点包

括胺、氨基化合物、醇、酮、砜、磺胺、羧酸、氨基甲酸、胍、脒、脲和酯等，并且药效点的杂原子间应被一个以上的碳原子所分隔，否则只算做一个药效点，同环的多个氨基只能算一个药效点，吡咯、吲哚、噻唑等不算药效团；③具有一个以上的羧基的化合物是非类药性分子，无环结构的化合物

一般为非类药性分子。2023/4/192023/4/12、模版法◼与排除法相反，模版法是利用已知药物结构的有用特征对设计的化合物进行评价，有很多相应的方法，如优先结构法、人工智能分类法等。2023/4/1102023/4/1⑴优先结构法◼所谓的优先结构指的是可以和相应受体和酶紧密结

合的特征结构类型，优先结构可来源于已知药物，也可以来自于天然产物，一般是紧密的杂环、多环体系，在指定的三维空间中可以诱导出不同的替代模式◼优先结构的内涵已经扩展到药物分子中经常发现的结构片段，目前已经有了商业化的片段库，可以在数据库中提取优先的子结构。◼32个基本分子构架就包括了所有分子的5

0%,其中最常见的结构是六元环2023/4/1112023/4/1⑵人工智能分类法◼模版法虽可提供明确的指导，但并不能使涵盖的所有分子具有类药性。◼模仿认知机制的人工神经智能网络被用于药物识别模式，通过检验药物可能的内在特性（如原

子类型、LogP、分子量等）来区分药物和非药物（不具有类药性）。2023/4/1122023/4/13、直接性质预测◼由于类药性的概念非常模糊，而一个化合物能否成为一个药物，与化合物的许多性质相关联，这些性质中只有一部分是依赖于结构

的，因此基于化学结构的类药性预测当然也存在着这样或那样的问题。◼先导化合物优化中遇到的问题和类药性问题实际上是相同的，即减少毒性、提高溶解性，增加生物利用度、改善血脑屏障穿透能力和增加代谢稳定性等。2023/4/1132023/4/1⑴溶解性◼药物作用的所有阶段都

与溶解性密切相关，但溶解性又是一种很复杂的现象，很难被准确的预测。◼溶解性与化合物的亲脂性、和溶液之间形成的氢键数、分子内的氢键数、官能团的离子化程度以及晶体的特征（特别是结晶形态和能量）等因素有关。◼有一种利用标准回归统计的方法可以用于溶解度和其他物理性质的计算，这种方法基于对整体分子的物理

描述，包括溶剂可及表面积、Lennard-Jones作用能、氢键给体和受体数目、氨基和硝基的数目等进行计算。2023/4/1142023/4/1⑵口服利用度◼即口服剂量中能到达血液循环部分的比例，它也与各种因素有

关，包括药物的溶解性、化学稳定性和代谢稳定性、膜渗透性等◼膜的渗透率与极性表面区域和亲脂性等因素有关，现在已经有一些有效的预测膜渗透性的统计模型可以利用。2023/4/1152023/4/1⑶血脑屏障穿透◼与膜渗透相似，血脑屏障穿透率与药物的亲脂性系数（l

ogP）、氢键数目、离子化程度、分子大小以及柔性等有关◼有人提出一个简单的QSAR方程来用于计算药物在脑中和血液中的比率：log（c脑/c血）=-0.0148×PSA+0.152×ClogP+0.1392023/4/1162023/4/1⑷代谢稳定性◼至今为止，虽然有许多软件可以进行预测代谢稳定

性，但仍没有特别可靠的方法进行预测，MetabolExpert和META等程序可以预测化合物的代谢途径，但是又难以说明产生这些代谢的可能性有多少。2023/4/1172023/4/1⑸毒性◼化合物产生毒性的原因很多，包括药物与DNA或者蛋白质作用，或

干扰了酶系统等。◼相应的毒理学数据库如RTECS（含10万个以上的化合物数据）和TOXSYS（24万个化合物数据）可以参考◼基于专家系统的计算也可预测化合物毒性，这些系统包含了那些具有潜在产生毒性的结构片段，如基于规则的DEREK和HazardExpert、To

xAlert等以及基于系统的QSAR-TOPKAT和CASETOX等。2023/4/1182023/4/1存在问题◼类药性规则定义不确切，难以适用于所有体系。◼应考虑类药性规则的使用环境，而不能不加区别的使用，如一个长时间服用的中枢神经系统药物和一个仅需要短期使用快速奇效的静

脉注射药物就需要使用不同的规则加以判断。◼各种分类方法均没有反映出已知药物的特性，并妨碍新的结构类型药物的发现；◼分类方法使用了已知的药物相应的数据库，因而所得到的结果可信度依赖于数据库的完整性。2023/4/1

192023/4/1结论◼合理药物设计---药物设计的发展方向◼计算机辅助药物设计的发展趋势2023/4/120ThePrincipleofDrugDesign—第六章ywjfc@mails.tjmu.edu.c

n基因技术及基因药物的发展基因技术方法与基因有关的药物设计2023/4/121◼基因技术是一系列有关研究基因结构和功能的方法之一，是一项将生物的某个基因通过基因载体运送到另一种生物的活性细胞中，并使之无性繁殖（称之为“克隆”）和行使正常功能（称之为“

表达”），从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术，描述这些方法的术语包括“DNA重组技术”、“基因工程”、“基因拼接”等。一、什么是基因技术6-1基因技术及基因药物的发展2023/4/1221．利用基因工程技术可以获得天然来源难以得到的生理活性物质，并可提供足量的生物活性物质以进行结

构、功能、性质等方面的研究，使之成为新药，并避免由于免疫抗原性等原因而带来的副作用。2.利用基因工程技术可以向生物环境中引入能编码目的蛋白质的基因，这种蛋白质可再此环境中被大量的生产。○例如使某些活性蛋白、多肽基因

在微生物、细胞以及动物、植物反应器中得到高效表达，使许多难以得到的生物活性物质如胰岛素、干扰素等批量生产。基因技术的优点2023/4/1233．利用基因工程技术可不断发掘和开发更多的新型生理活性物质。○例如红细胞生长素（EPO）、神经生长因子（NGF）等。4.利用基

因工程技术可以改造内源性活性物质，对蛋白质的特异位置进行修饰，可以改变氨基酸的序列，在编码基因中引入特异的突变体，从而改变其物理化学性质，提高其生物活性、减少副作用○如将组织纤溶酶原激活剂tPA分子重组缩

小后，半衰期明显延长，注射一次即可溶栓。2023/4/1245．通过基因重组技术，能够获得新的化合物（包括自然界不存在的化合物），扩大药物来源，这正是制药工业引进基因工程的主要原因之一。2023/4/125◼1973年,美国斯坦福大学医学院Pr

of.Coben及其研究小组把大肠杆菌质粒DNA酶切后插入抗四环素基因,组成一个可在大肠杆菌种复制,并表达出具有抗四环素及大肠杆菌质粒DNA双抗遗传表型的重组子第一次的基因重组2023/4/126◼日新月异的生物技术不断推动着这场革命，生物工程药物将成为21世纪

药业的支柱。◼与生物制药直接相关的最新领域包括；组合化学（combinatorialchemistry）、药学基因（pharmacogenomics）、蛋白组学（proteomics）、蛋白治疗（genether

apy）、功能抗原学（functionalantigenics）、生物信息学（bioinformatics）、高通量筛选（high-throughputscreenign）和众所周知的基因组学（genomics，包括后

基因组学）等。基因药物是多学科共同发展的结晶2023/4/127一基本知识二基因技术的一般介绍三重组蛋白的表达6-2基因技术方法2023/4/128一、基本知识2023/4/129◼染色体上具有遗传作用的是脱氧核糖核酸即DNA。DNA链由两条碱基互补的脱氧核苷酸链反

向平行旋转形成双螺旋结构。每个脱氧核苷酸由一个碱基、一个脱氧核糖及一个磷酸分子组成。碱基的不同决定了脱氧核苷酸种类的不同。◼DNA中的碱基种类有四种：腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）。

◼基因是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。◼基因是带有遗传性状的DNA片段，每个基因具有自身的遗传密码。基因决定着蛋白质的合成，有“一个基因一个多肽链”的说法。◼基因决

定蛋白质，蛋白质决定代谢作用，代谢作用决定各种性状。㈠、基因的化学本质2023/4/130②DNADNA的二级结构◼1953年，J.Watson和F.Crick在前人研究工作的基础上，根据DNA结晶的X-衍射图谱和分子模型，提出了著名的DNA双螺旋结构模型，并对模型的生物学意义作出了科学的

解释和预测。核酸2023/4/141DNA双螺旋结构的特点◼DNA分子由两条DNA单链组成。◼DNA的双螺旋结构是分子中两条DNA单链之间基团相互识别和作用的结果。◼双螺旋结构是DNA二级结构的最基本形式。核酸2023/4/142DNA双螺旋结构的要点

（1）DNA分子由两条多聚脱氧核糖核苷酸链(简称DNA单链)组成。两条链沿着同一根轴平行盘绕，形成右手双螺旋结构。螺旋中的两条链方向相反，即其中一条链的方向为5′→3′，而另一条链的方向为3′→5′。202

3/4/143（2）嘌呤碱和嘧啶碱基位于螺旋的内侧，磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直，糖基环平面与碱基环平面成90°角。DNA双螺旋结构的要点2023/4/144（3）螺旋横截面的直径约为2nm，每条链相邻两个碱基平面之间的距离为3.4nm，每10个

核苷酸形成一个螺旋，其螺矩（即螺旋旋转一圈）高度为34nm。DNA双螺旋结构的要点2023/4/145DNA双螺旋的稳定性◼DNA双螺旋结构在生理条件下是很稳定的。◼维持这种稳定性的因素包括：两条DNA链之间形成的氢键；◼由于双螺旋结构内部形成的疏水区，消除了介质中水分子对碱基之间氢键的影响

；介质中的阳离子（如Na+、K+和Mg2+）中和了磷酸基团的负电荷，降低了DNA链之间的排斥力、范德华引力等。◼改变介质条件和环境温度，将影响双螺旋的稳定性。2023/4/146⑶核酸的三级结构◼在三叶草型

二级结构的基础上，突环上未配对的碱基由于整个分子的扭曲而配成对，目前已知的tRNA的三级结构均为倒L型核酸2023/4/147核酸2023/4/148核酸2023/4/149◼基因的定义基因是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。基因是决定一条多肽链的D

NA片段。◼分类根据其功能把基因分为三类1.编码蛋白质的基因，它具有转录和翻译功能，包括编码酶和结构蛋白的结构基因以及编码阻遏蛋白的调节基因；2.只有转录功能而没有翻译功能的基因，包括tRNA基因和rRNA基因；3.不转录的基因，它对基因表达起调节

控制作用，包括启动基因和操纵基因。启动基因和操纵基因有时被统称为控制基因。2023/4/150基因的结构2023/4/1512023/4/152中心法则◼生物的遗传信息从DNA传递给mRNA的过程称为转录。根据mRNA链上的遗传信息合成蛋白质的过程，被称为翻译

和表达。1958年Crick将生物遗传信息的这种传递方式称为中心法则。DNARNA蛋白质转录反转录翻译复制复制2023/4/154◼mRNA是DNA的转录本，携带有合成蛋白质的全部信息。蛋白质的生物合成实际上是以mRNA作为模板进行的。2023/4/1

58遗传密码◼mRNA分子中所存储的蛋白质合成信息，是由组成它的四种碱基（A、G、C和U）以特定顺序排列成三个一组的三联体代表的，即每三个碱基代表一个氨基酸信息。◼这种代表遗传信息的三联体称为密码子，或三联体密码子。◼因此mRNA分子的碱基顺序即表示了所合成蛋白

质的氨基酸顺序。◼mRNA的每一个密码子代表一个氨基酸。20种基本氨基酸的三联体密码子都已经确定。此外，还有一个密码子是肽链合成起始密码子,三个是终止密码子，以保证蛋白质合成能够有序地进行。2023/4/159遗传密码2023/4/160㈠、基因技术

的特征及研究内容㈡基因工程的基本方法总结㈢基本的DNA克隆技术㈣PCR技术2023/4/161㈠、基因技术的特征及研究内容◼1、基因工程的定义◼基因工程（geneticengineering），也叫基因操作、遗传工程，或重组体DNA技

术。它是一项将生物的某个基因通过基因载体运送到另一种生物的活性细胞中，并使之无性繁殖（称之为"克隆"）和行使正常功能（称之为"表达"），从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。2023/4/162◼基因工程是专指用生物化学的方法，在体外将各种来源的遗传物

质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的DNA片段）与载体系统（病毒、细菌质粒或噬菌体）的DNA结合成一个复制子。◼复制子所在的宿主生物或细胞中复制，继而通过转化或转染宿主细胞、生长和筛选

转化子，无性繁殖使之成为克隆。◼直接利用转化子，或者将克隆的分子自转化子分离后再导入适当的表达体系，使重组基因在细胞内表达，产生特定的基因产物。2023/4/163◼基因工程中内外源DNA插入载体分子所形成的杂合分子又称为嵌合DNA或DNA嵌合体（D

NAchimera）。◼构建这类重组体分子的过程，即对重组体分子的无性繁殖过程又称为分子克隆（molecularcloning），基因克隆（genecloning）或重组DNA（recombinantDNA）。2023/4/1642、基因工程的特征◼基因工程有两个重要的特征：◼可

把来自任何生物的基因转移到与其毫无关系的其他受体细胞中，因此可以实现按照人们的愿望，改造生物的遗传特性，创造出生物的新性状；◼某一段DNA可在受体细胞内进行复制，为制备大量纯化的DNA片段提供了可能，拓宽了分子生物学的研究领域。2023/4/165◼3、基因工程的研究内容◼基

因工程的研究内容主要包括：◼从复杂的生物体基因组中采用鸟枪克隆法、人工合成法等方法分离并获得带有目的基因的DNA片段；◼在体外将含目的基因的DNA片段和具有自我复制功能、并带有选择性标记的载体分子进行酶切连接，获得

重组DNA分子；◼利用特定的方法将重组DNA分子转移至适当受体细胞（寄主细胞），并与其同步增殖；◼从大量的细胞繁殖群体中，筛选出克隆有重组DNA分子的寄主细胞；◼将目的基因克隆至适当的表达载体，采用特定的方法将基因导入受体细胞，使其在新的遗传背景下获得

活性表达，从而得到需要的特定目的物质。2023/4/166基因工程流程模式图2023/4/167㈡、基因技术在药物研究中的基本方法◼基因技术可将已知编码蛋白基因导入生物环境并使蛋白能够被大量的表达，同时还可以改变蛋白特定位

置上的氨基酸的位置，既可以对氨基酸个点位置、也可以使编码蛋白基因中特定位置的突变等。◼具体的方法包括◼基因重组技术，如cDNA的克隆、PCR扩增等；◼重组蛋白的表达，表达宿主包括大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞、转基因动物等；◼新型蛋白质设计，新

设计的蛋白包括天然蛋白质的变异物、不同蛋白质结构域的嵌合物等。2023/4/168㈢、基因技术中常用的工具酶◼基因工程使用的每一种工具酶都具有自身特定的功能。※有的像“手术刀”（限制性核酸内切酶），可以进行DNA分子

的特定切割；※有的像“粘合剂”（DNA连接酶），可以促进DNA分子之间的粘合和连接；※有的像“砌砖机”，可以合成完整的双链DNA分子。◼其他基因工程常用的工具酶，还有末端转移酶、单链核酸酶和反转录酶等。2023/4/169◼限制性内切酶(RestrictionEndonuclease)

简称限制酶，能够识别DNA大分子链上特定的核苷酸顺序，并能在某一特定部位将DNA断裂。这样，目的基因便有可能完整地存在于某一DNA片段上，然后再把它们分离出来。◼在基因工程中，限制酶是进行DNA分子切割的特殊工具,具有“分子剪

刀”或“分子手术刀”之称。◼已经发现的限制酶多达20多种。每一种都有极强的特异性，可以准确无误地进行核苷酸的识别，1、限制性核酸内切酶2023/4/170◼根据限制性核酸内切酶在识别和切割序列方面的特性（切割位点）、分

子量的大小、酶蛋白的结构、催化条件（反应所需的辅助因子等）和修饰活性，将限制酶分为I、Ⅱ、Ⅲ三类，然而在基因克隆中具有实用价值的只有Ⅱ类限制酶。◼Ⅱ类限制酶的特性◼①识别特点不同的限制酶对DNA识别序列是不同的，多数限制酶能够识别有4~8个碱基对组成的特定核苷酸序

列，识别位点的一个共同特征是核苷酸顺序通常呈双重旋转对称结构，即回文序列，如EcoRI为5`-GAATTC-3`（较严格而独特的识别序列），HaeI为（序列中某些部位可有灵活性），2023/4/171◼②切割方式切割位点相对于双对称轴

的位置而言，可有两种不同的切割方式：一种是在识别序列对称轴两侧相同的位置分别切割DNA，得到粘性末端（cohesiveend，简称粘端）；地二种是在对称轴处同时切割DNA双链，产生具有平端（blumend）的DNA片段（5`-GAATTC-3`3`-C

TTAAG-5`EcoRI5`-G3`-CTTAAAATTC-3`G-5`+5`-粘端5`-CTGCAG-3`3`-GACGTC-5`PstIG-3`ACGTC-5`5`-CTGCA3`-G+3`-粘端5`-CCCGGG-3`3`-G

GGCCC-5`5`-CCC3`-GGGGGG-3`CCC-5`+SamI平端2023/4/172◼③同裂酶与同尾酶虽然来源不同但是能够识别相同的核苷酸序列，并且切割方式也相同限制酶称之为同裂酶；将那些虽然来

源不同，识别序列和切割方式都不同、但切割后可产生相似的粘性末端的限制酶称为同尾酶。◼④末端的连接同一种酶或者不同的酶经梅切后产生的匹配粘端可在连接酶作用下直接进行连接，这是DNA重组最常用的方法。虽然平度也可以直接连接，但是效率较低

。此外不匹配粘端在经过一定的修饰后，也可以进行连接。◼⑤影响限制酶活性的因素影响限制酶的活性的因素很多，包括DNA的纯度、钩型、甲基化程度以及缓冲溶液的选择、反应温度（多数最佳温度为37℃，也有些不是）、酶的活

性、用量、反应速率（酶切时间）等。2023/4/173◼2、DNA连接酶◼能催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键,它要求一条DNA的3`末端有一条游离羟基,并且在另一条DNA链的5`末端有一个有一个磷酸基团。并且它只

能连接双螺旋的DNA分子，而不能连接单链的或者环化的单链DNA分子。◼3、其它的酶◼除上述的酶以外，在基因工程中还经常用到能够以DNA或者RNA为模版，在体外合成DNA的DNA聚合酶。比较重要的包括大肠杆菌DNA聚合酶I、kleno

w酶、T噬菌体DNA聚合酶等；DNA聚合酶、测序酶、逆转录酶、末端转移酶、核酸修饰酶等。2023/4/174◼生物具有很强的排他性，目的基因很难进入不同种属的细胞中，即使能够进入细胞中，叶不能进行复制和繁殖，它必须与具有自我复制能力的DNA共价结

合后才能被复制，这种具有在细胞内进行自我复制的DNA分子就是外源基因的运载体。在基因技术中，基因运载体（vector）的设计与应用是一个重要环节。㈣．运载体2023/4/175◼1、运载体的类型◼运载基因的载体作媒介物是必要的经常使用的载

体，目前用于基因制药的基因运载体主要包括：①质粒——环状双链小型DNA分子，种类甚多，有的可在细菌细胞内独立复制，有的亦可用于动、植物细胞。例如：根瘤土壤杆菌所携带的Ti质粒常用作植物细胞基因工程的载体。人工改造的质粒常用的有pBR322天然质粒，派

生质粒pmB1，psC101等；②噬菌体——常用的是λ噬菌体，经构建后，常用于细菌细胞。此外还有Mu噬菌体载体等；③病毒——例如猿猴空泡病毒SV40常用作动物细胞基因工程的载体；④粘粒（cosmid，装配性质粒），由质粒和Mu噬菌体的cos位点或膜等构建而成的一

种大容量克隆载体等。◼不同的载体，分子量大小、结构和用途上存在着较大的差异2023/4/1762、作为运载体的条件◼用于基因克隆载体的理想质粒应能够满足：⑴具有复制起始点，即具有复制子功能，且复制起始区中没有所需的限制酶切位点，并可维持使每个细胞含有一定的质粒拷贝数，一般，一个质粒只含有一

个复制起始点，构成一个独立的复制子。⑵具有两个易被检测的选择形标记，一个理想的质粒克隆载体应具有两种抗生素抗性基因，以便为寄主细胞提供易于检测的选择形标记。⑶具有多种限制酶的单一识别位点，适用于各种限制酶产生的DNA片段的插入，以满足基因克隆的需要，在插入适当大

小的外源DNA片段后，应该不影响质粒DNA的复制功能。⑷应具有尽可能小的分子量，以利于分离纯化等条件2023/4/1773、载体的共性◼能在受体细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制。在其DNA插人外源基因后，仍然保持稳定的复制状态和遗传特性；易于从宿主

细胞中分离，并进行纯化；◼在其DNA序列中，具有适当的限制性内切酶位点。这些位点位于DNA复制的非必需区内，可在这些位点上插人外源DNA，但不影响载体自身DNA的复制；2023/4/178◼基因工程的原料就是目的基因。所谓目的基因，是指已被或欲被分离、改造、扩增和表达的特

定基因或DNA片段，能编码某一产物或某一性状。◼目前获取目的基因的方法主要有三种：※反向转录法※从细胞基因组直接分离法※人工合成法。㈤、目的基因的获取2023/4/179（1）反向转录法：◼主要用于分子量较大而又不知其序列的基因.以目的基因的mRNA为模板，借助反转录酶合成碱基互补的

DNA片段，即cDNA，再在DNA聚合酶的催化下合成双链cDNA，亦即目的基因的双链DNA。2023/4/180（2）从细胞基因组中直接分离：包括两个主要步骤：①基因文库组建◼提取细胞的整体DNA，用内切酶或其它方法将完整的双链DNA分子随机切割成适当长度的片

段，得到的DNA片段群的某一片段上可能刚好有所需要的目的基因；然后把这些片段连接到合适的基因载体上，引入受体细胞中进行分子克隆，即进行目的基因的增殖。◼测定所有含有重组DNA的克隆的个数，插入的染色体DNA片段的长度，加以统计处

理，计算出克隆里包含的某物种染色体DNA遗传信息量的概率。如果库内所有的重组DNA克隆上的染色体DNA已经代表了这个物种遗传信息量的95％以上，那么这个基因文库就建成了。2023/4/181②检索◼挑选含有特定目的基因的单一受体细胞。利用某种检测方法根据重

组克隆株明显的表型变化，通过直接观察挑选利用"核酸探针"，直接检测细胞内的目的基因。核酸探针是用放射性同位素或其他标记物标记的DNA片段，具有非常特异的序列，能与互补链结合，因此用它可以进行特定基因的检测。◼用"鸟枪法"分离目的基因，具有简单、方便和经济等优点。许

多病毒和原核生物、一些真核生物的基因，都用这种方法获得了成功的分离。2023/4/182（3）人工合成：依照某一蛋白质的氨基酸序列，即可按密码子推算出其基因的核苷酸序列，随后应用化学合成法，就可在短时间内合成目的基因2023/4/183（1）获取目的基因即用各种不同

的方法取得人所需要的基因，也就是某些DNA片段。那里面含有一种或几种遗传信息的全套遗传密码。获取目的基因是基因工程操作的关键。（2）获取基因载体用人工方法，取得目的基因的适宜的载体，即质粒或病毒。载体一般带有必要的标志基因，以便进行检测。㈤基因工程的基本方

法总结2023/4/184(3)重组DNA即用人工方法，让目的基因与运载体相结合，首先要用限制性内切酶和其他一些酶类，切割或修饰载体DNA和目的基因，然后用连接酶将两者连接起来，使目的基因插入载体内，形成重组DNA分子。这些工作都在生物体外进行，所以基因工程操作又叫

体外DNA重组。（4）把重组DNA导入受体细胞进行扩增即用人工方法，让携带着目的基因的运载体进入新的生物细胞里，让其增殖，由此形成重组DNA的无性生殖系（即克隆）。（5）筛选与培育即基因表达产物的鉴定、收集和加工等一系列复杂过程的

综合。2023/4/185基因工程操作流程图合成基因基因组DNA组织、器官、细胞mRNAcDNA克隆基因文库合成文库、基因组文库、cDNA文库载体构建细菌质粒、病毒等蛋白质氨基酸序列核酸序列寡聚核苷酸探针肽链合成目的基因克隆DNA序列筛选多肽抗体目的基因转移原核细胞表达真核细胞表达植

物中表达动物中表达人体表达发酵工程转基因植物动物器官反应器转基因动物基因治疗治疗遗传性疾病提取产品蛋白质表达筛选2023/4/1866-3与基因有关的药物设计◼一、核酸的作用基础◼二、以核酸为靶点的药物设计◼三、基因突变、基因重组与药物设

计2023/4/189一、核酸的作用基础◼基因的研究已经深入到许多领域，但研究的基础却可以用一个模型、一个法则和四个概念来简述：◼一个模型：1953年由Watson和Crick提出的DNA的双螺旋模型

，基因研究的结构基础；◼一个法则：基因表达的中心法则指的是生物的遗传信息从DNA传递给mRNA的过程称为转录。根据mRNA链上的遗传信息合成蛋白质的过程，被称为翻译和表达。◼四个概念：复制（replicatio

n）、转录（transcription）、翻译(translation)和密码子(codon)2023/4/190中心法则◼DNA复制与生物遗传信息的保持※在复制开始阶段，DNA的双螺旋拆分成两条单链。※以DNA单链为模板，按照碱基互补配对的原则,在DNA聚合酶催化下，合成与

模板DNA完全互补的新链，并形成一个新的DNA分子。※通过DNA复制形成的新DNA分子,与原来的DNA分子完全相同。经过一个复制周期后，子代DNA分子的两条链中，一条来自亲代DNA分子，另一条是新合成的

，所以又称为半保留复制。DNA储存的一维信息转录RNA储存的一维信息信息加工RNA折叠结构（一维及三维信息）翻译蛋白质的折叠结构（遗传的一维及三维信息）2023/4/191二、以核酸为靶点的药物设计◼研究表明，中心法则

不仅适用于正常的基因的复制、转录和翻译等，某些疾病的产生也遵循中心法则。因此，药物的设计既可以以蛋白质为靶点，同样也可以以核酸为靶点。以核酸为靶点的药物研究主要从下面两个方面进行的：◼⑴阻断疾病基因的表达基因表

达调控理论的发展，肿瘤基因的表达也遵循中心法则。在复制、转录、翻译等环节中对肿瘤、病毒等基因的表达进行阻断是可能的。。◼⑵调整或关闭导致疾病产生的酶和受体的合成按照中心法则，所有的蛋白酶、受体的合成都受制于DNA、RNA的编码和组织。

以核酸为靶点的药物设计可以通过抑制有害蛋白的合成而将疾病阻断在早期阶段。是关闭或调整某些不正常酶或受体合成的有效途径。◼在药物设计中对核酸的分子识别非常重要。2023/4/198◼目前，以核酸为靶点的药物设计主要集中在◼反义核酸（anti-sense

nucleicacid）◼酶性核酸(核酶，ribozyme)的设计◼小分子与核酸的相互作用◼其它2023/4/199㈠、反义核酸技术◼反义核酸（包括asRNA和asDNA）是以选择性抑制特定基因为目的，根据碱基配对原则、核酸杂交原理等设计的一

类新的核酸。◼反义核酸技术主要包括反义RNA（asRNA）和反义DNA（asDNA）等两种类型，反义核酸可用化学方法合成，也可以利用载体来携带编码的反义RNA，再将表达载体导入细胞内。◼该技术可以根据已知序列基因设计出特异性的干扰其表达的药物，在抗病毒和抗肿瘤药物研究方面具有重要的意义

。2023/4/1100◼其中asRNA是能与靶分子mRNA序列互补的RNA片断，通过碱基对间氢键的作用与靶mRNA形成双链复合物而影响基因的转录、翻译和加工过程，从而调控基因的表达。从作用机制来看，asRNA属于负调控机制，可在生物体内进行多层次的控制，如抑制质粒的复制

、调节细菌内质粒的拷贝数、在转录和翻译水平上调控基因的表达，2023/4/1101◼asDNA是一段人工合成的能与特定基因某一区域互补的正常或经过修饰的寡聚脱氧核苷酸（oligodeoxynucleotide，ODN)或其化学修饰物，长度一般在20个碱基左右

，能够封闭或抑制该基因的表达。2023/4/1102核酸的杂交◼热变性的DNA单链，在复性时并不一定与同源DNA互补链形成双螺旋结构，它也可以与在某些区域有互补序列的异源DNA单链形成双螺旋结构。◼这样形成的新分子称为杂交DNA分子。DNA单链

与互补的RNA链之间也可以发生杂交。◼核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。2023/4/1103核酸的杂交2023/4/1104◼反义核酸的研究对于发展基因水平治疗药物，具有高度特异性（通过特异的碱基互补配对作用于靶点），高效性（直接阻止靶基因的转录和翻译），最优化的药物

设计（针对靶基因的序列进行理性化的设计），低毒、安全（易被降解清除），合成相对较容易等一系列的优点。对于针对靶点进行高特异性、强选择性药物设计具有重要的指导意义。2023/4/1105㈡、酶性核酸（核酶）◼1982年CechT等首先发现具有催化作用的RNA，并于1989年与Alt

man（1984年发现另一个核酶）获得诺贝尔奖。因此就把这种具有核酸结构但可以发挥酶的功效，既能储存和转运遗传信息，又能发挥生物催化功能的RNA分子，称为酶性核酸（简称核酶，Ribozyme）。2023/4/1106天然核酶的分类根据催化反应类型剪切性核酶锤头型核酶发夹型核酶丁型肝炎病毒核酶

（斧头型）PNaseP13~40bp50bp60bp290~400bp自体剪切自体剪切自体剪切、自体催化异体剪接、异体催化剪接型核酶I型内含子II型内含子200~1000bp〉1000bp自体剪接、自体催化自体剪接2023/4/1107◼核酶具有的特性：◼⑴.

可以通过识别特定位点而抑制目标基因的表达，抑制效率高，专一性强。◼⑵.免疫源性低，很少引起免疫反应。◼⑶.针对锤头核酶而言，催化结构域小，既可作为转基因表达产物，也可以直接以人工合成的寡核苷酸形式在体内转运，导致其在

医学、生物化学等方面的得到广泛的重视。2023/4/1108◼在医学、农学等方面的应用已引起人们的重视，在病毒性肝炎、HIV病毒、肿瘤等方面已有了长足的进展。◼1998年，美国加利福尼亚大学Wong-Staal等利用发夹核酶抑制HIV-Ⅰ基因表达，并率先进入临床Ⅰ期。核

酶能在特定位点准确有效地识别和切割肿瘤细胞的mRNA，抑制肿瘤基因的表达，达到治疗肿瘤的目的2023/4/1109㈢、作用于核酸的小分子药物◼小药物分子对包括核酸在内的生物大分子的选择性作用与其对生物靶分子的识别密切相关，这种识别作用

不仅包括对于生物靶分子的整体识别，也包括对于对生物靶分子某一特定部位特定结构的识别（包括对一级结构、二级结构及相应高级结构的识别）。◼识别过程包括选择过程和键合过程，互补性规则是关键空间结构的互补、电性的互补以及能量的互补等，◼空间结构的互补包括静态的、动态的和诱导契合过

程，即构象的重组织。◼电性特征的互补是指氢键的形成、静电作用、π键的堆积及疏水作用中键合位点上电荷分布的最佳匹配等。2023/4/1110◼为了达到较好的效果，识别双方应尽可能满足相应的条件：◼靶分子的识别位点附近具有足够的空间，以增加识别双方的接触面积

，从而产生更多的非键和有键相互作用。◼生物大分子功能（如基因的转录、表达、调控等）的发挥取决于依赖于非键作用而产生的空间构象，为此识别双方应该尽可能的满足空间互补和电性互补等必需条件。◼生物大分子结构的稳定性需要刚

性的分子结构，而识别过程中构象的转换，变构过程、调控、协同作用都需要一定的柔性。柔性是分子动态性质的表现，有柔性才有大分子的构象重组，才会有大分子和小分子的完美结合，因此分子识别要考虑刚性与柔性的平衡，兼顾动态和静态的性质，。2

023/4/11111、小分子药物与DNA的识别与作用方式◼小分子药物与DNA结合常常诱发许多生物效应，这种结合包括共价结合和非键结合。◼共价结合包括与亲核（或亲电）试剂作用，DNA的烷基化、DNA的链内交联、链间交联等；非键结合包括外部静电作用、嵌插结合、沟区（大沟区、小沟区）结合等三种2023

/4/1112◼⑴共价结合早期的抗癌药物仅具有简单的DNA烷基化功能，如氮芥类（nitrogenmustards），亚硝基脲类（nitrosoureas）等，选择性较差，毒副作用较大。某些具有抗肿瘤作用的天然化合物（抗生素

类）先与DNA形成非共价键复合物，然后再与之共价结合。NNNNNOOHOHHHHHHOHHONHH3CNHNOOHCH3ONHNOOHCH3ONH2OH2023/4/1113◼金属配合物多数是外源性物质，进入人体内后,占据或竞争生物配体,当其占据必需金

属的结合部位时,会引起必需金属平衡失调;当与关键性生物分子如DNA结合时变会引起某一方面的异常而产生毒性。当有毒物质接触异常细胞,从而使异常细胞死亡或受到抑制,阻止它繁殖下去,则细胞毒性便转化为治疗作用。用细胞毒性物质治疗肿瘤、病毒感染,牛皮癣等病的指导思想就是

"以毒攻毒"，杀伤异常细胞2023/4/1114水合PtAAH2OH2OPtAADNA细胞核生物效应DNA复制受阻PtAAXXZZPtAAXX细胞膜PtAAXXZZPtAAXX2+2+2023/4/1115⑵非共价结合◼

外部静电作用※核酸可被认为是高度带电的聚合电解质，其阴离子磷酸根部分对于DNA的构象和反应具有明显的影响。这种带电荷的高聚物的构象需要小分子沿着螺旋外部产生的静电相互作用的协同作用才能稳定存在◼这种作用是非特异性的。2023/4/1116沟区结合◼由于DNA的螺旋结构产生的大小沟区在电势能、氢

键特征、立体效应、水合作用等方面都有很大的不同，小沟区是AT富集区，大沟区是GC富集区。◼一般蛋白质和DNA的特异性结合都是发生在DNA的大沟区。而GC富集的大沟区比较分散，药物小分子结合时特异性较差，因此药物一般是在小沟区

作用，特别是含有呋喃环、吡咯或苯环等芳香杂环结构的小分子药物更是如此。芳香环间以旋转自由的键连接，可产生相应的构象以配合小沟区的螺旋曲线，取代小沟中的水分子并可与双螺旋链中沟区的碱基对边沿通过范德华力相结合。2023/4/1117◼药物小分子通过与胸腺嘧啶

碱基C2上的羰基氧或腺嘌呤碱基N3位上的N形成氢键而结合，同时AT小沟区负的静电势大于GC富集区，有利于与药物结合。因此药物小分子选择性的作用于DNA双链的AT丰富区域，通过氢键及范德华力作用，非嵌入性作用于DNA，阻止

DNA的模版复制，从而起到抗病毒、抗肿瘤作用2023/4/1118DNA的大沟与小沟小沟区大沟区2023/4/1119◼DNA是结构上最有特征的生物聚合体靶点，一些新药具有选择性识别确定核苷序列的能力，在特定基因水平上发挥抗癌活性，抗病毒药物纺锤霉素（netropsin）属于DN

A小沟结合配基，与DNA双螺旋的AATT中心（小沟区）结合，取代了该区中寡聚核苷酸水合骨架部分，netropsin在构象上适合DNA小沟的螺旋形状，具序列选择性，又称为序列读码分子。与DNA小沟结合后，会损伤DNA并使细胞死亡2023/4/1120◼嵌插结合◼Lerman在

1960年提出，具有平面芳香稠环结构的分子能够以嵌插的方式与DNA相结合。嵌插的结果使碱基对分开，螺旋伸长大约0.34nm，螺旋的扭转角减小（<36°正常值），不同嵌插剂及不同的DNA导致的解链程度不同。药物丙基哌啶丫啶类柔红

霉素、阿霉素解链角26°17°11°2023/4/1121◼由于小分子药物嵌入到DNA螺旋结构，导致DNA构象变化，最终不能或不易复制，达到抗肿瘤或抗病毒的目的。◼与沟区结合相比，嵌插结合的选择性和专一性较差，只有那些带有与非邻近碱基接触的取代基的嵌插或者可引起邻近结合部位DNA链扭曲的嵌插剂

，才可能有一定的选择性，但同时也与相应的氢键特性、立体效应、水合程度及沟区的静电势等因素有关。2023/4/1122◼断裂DNA※在DNA修复、转录和突变等过程中，非常重要的一步就是DNA断裂、因此在研究小分子与大分子的识别过程中，对DNA断裂剂的研究非常重要。按照来源不同，可将DNA断裂剂分为

合成的、天然的两大类。※其中合成的断裂剂包括EDTA-Fe类衍生物（AT区断裂）；1,10-二氮杂菲铜螯合物；邻菲罗啉配合物等三种类型，其作用机理是先嵌插结合，再导致DNA特异性断裂2023/4/1123三、基因突变、基因重组与药物设计◼生物药物的克隆及表达◼具体

的宿主很多，如以大肠杆菌（1977年，生长抑素、生长激素释放抑制因子、β-半乳糖苷酶操作因子等），酵母（胰岛素、肝炎B疫苗等）等。传统的方法是从牛的胰脏中提取，每1000磅牛胰脏，可得10克胰岛素。通过基因工程方法，把编码胰岛素的基因送到大

肠杆菌细胞中去，造出能生产胰岛素的工程菌；从200升发酵液就可得到10克胰岛素。◼生产基因工程药物的基本方法：将目的基因用DNA重组的方法连接在体载体上，然后将载体导入靶细胞（微生物，哺乳动物细胞或人体组织靶细胞），使目的基因在靶细胞中得到表达，最后将表达的目的蛋白

质提纯及作成制剂，从而成为蛋白类药或疫苗。若目的基因直接在人体组织靶细胞内表达，就成为基因治疗。2023/4/11242、重组受体与药物筛选◼传统的受体制备是从大量的组织匀浆中提取，利用重组受体技术把受体或受体亚型的基因从人体组织中克隆出来，再在微生物或哺乳动物细胞内表达。◼与传

统的受体制备技术相比，其优点为：※基因来自于人体组织，重组后的受体是人的而不是动物的，并且得到的受体在细胞内或细胞膜上，包含了G-蛋白等信号转导系统，更接近人体的自然状态，最终的试验结果与在人体试验的结果直接相关；※可大量制备用传统制备方法难以获得的、或只在特定组织中存在的以及纯

的受体；因此越来越多的研究者利用重组受体进行药物筛选研究。例如亲代谢谷氨酸受体、神经肽Y受体、A3肾上腺素受体亚型等多种重组受体已经建立并应用于药物筛选。2023/4/11253基因探针技术与药物筛选◼基因探针是指能识别特异碱基顺序的有

标记的单链DNA(或RNA)分子片段，也可以说是一段被测定的核苷酸顺序互补的带标记的单链核苷酸。将其与被检测的基因中的同源互补序列杂交，从而检测出所要查明的基因称之为基因探针技术。◼目前，已用于新药筛选中。红霉素、四环素、利福霉素、两性霉素、阿霉素等重要抗生素均作用于细菌的多聚乙酰

(polyketide)生物合成途经。在同样作用于这一生物合成途径的放线紫红素(actinorhodin)的生物合成基因组完全清楚后，建立了以actⅠ、actⅢ等基因片段作为探针，应用DNA-DNA同源杂交技术(southern印渍法)直接筛选产生作用于多聚乙酰途径的新抗生素产生菌的方法。2

023/4/1126㈡、蛋白质药物设计◼重组DNA技术使得天然蛋白和所设计的新蛋白质分子的生长成为可能。主要的方法包括通过位移、插入或取出少量氨基酸而得到的天然蛋白质突变体，通过不同蛋白之间相互嵌合而形成的嵌合蛋白以及设计全新的蛋白质等。2023/4/

1127◼重组DNA技术使得天然蛋白和所设计的新蛋白质分子的生长成为可能。◼类型：1.通过位移、插入或取出少量氨基酸而得到的天然蛋白质突变体2.不同蛋白之间相互嵌合而形成的嵌合蛋白3.设计的新型蛋白2023/4/1128天然蛋白质纯化和鉴定结构功能研究表达基因克隆3D-结构模型研究通过定向突变

设计新的蛋白质新型蛋白质药物的设计与循环2023/4/1129一、蛋白质突变体通过基因突变的方法，在编码区改变、删除、或插入一个或几个核苷酸而得到，蛋白质结构的微小变化将产生一系列物理和生化性质（溶解度、稳定性、

对第五首体的亲和力等）的改变。如新胰岛素分子的设计2023/4/11302023/4/1131Q&A问答环节敏而好学，不耻下问。学问学问，边学边问。Heisquickandeagertolearn.Learningislearningandas

king.132添加标题添加标题添加标题添加标题此处结束语点击此处添加段落文本.您的内容打在这里，或通过复制您的文本后在此框中选择粘贴并选择只保留文字133感谢观看Theusercandemonstrateonaprojectororcomputer,orprintth

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