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000405chmjampc1细菌耐药研究的进展及对策中山大学附属三院张扣兴000405chmjampc2抗生素时代细菌耐药性的问题“ThewarofHumanVsBacteria”Whowillbethelastwinner？“生命总会找到出路”摘自“失落的世界”000405chmj

ampc31940-1960年青霉素时代1953年耐药率达80%1960-1978年广谱青霉素和1,2代1970s出现携带多种耐药基因的菌株头孢菌素时代产头孢菌素酶的不动杆菌广泛流行1978-1995年广谱-内酰胺类时代细菌产超广谱-内酰胺酶(ESBLs和第3，4代头孢菌素BushI型-内

酰胺酶，细菌对三代单环内酰胺类头孢菌素和单环内酰胺类耐药-内酰胺酶抑制剂碳青霉素类1995-2000年？？全球范围内产诱导酶的肠杆菌对头孢他啶和头孢噻肟的耐药率高达20-70%控制细菌耐药不能单纯依靠研制和开发新

型抗生素MedeirosAA,etal.ClinInfectDis.1997;24(Suppl):S19-45SentryStudy2000-内酰胺类抗生素及其耐药菌发展史000405chmjampc4第三代头孢菌素代头孢菌素过度使用后过度使用后的选择作用选择作用G-G-G+G

+产ESBLESBL的大肠杆菌，肺炎克雷大肠杆菌，肺炎克雷伯菌伯菌等高产高产AMPCAMPC酶的肠杆菌属菌，枸橼肠杆菌属菌，枸橼酸菌，沙雷氏菌等酸菌，沙雷氏菌等MRSAMRSA，VREVRE，PRPPRSP对第三代，及第对第三代，及第四代头

孢菌素等四代头孢菌素等耐药耐药对第三代头孢菌素及对第三代头孢菌素及酶抑制剂复合制剂酶抑制剂复合制剂耐药耐药碳青霉烯类抗生素碳青霉烯类抗生素碳青霉烯类抗生素，碳青霉烯类抗生素，第四代头孢菌素第四代头孢菌素万古霉素万古霉素0

00405chmjampc5•耐万古霉素肠球菌和金葡菌。•耐青霉素肺炎链球菌。•多重耐药的结核菌。•产ESBLs和AmpC酶菌•多重耐药的嗜麦芽窄食单胞菌。•多重耐药的绿脓杆菌。人类征服耐药将面临着长期艰巨的任务。根本的办法是合理

有效使用抗生素，加强耐药菌的分子流行病学监控，及时阻断耐药菌传播000405chmjampc6细菌耐药机制1.产生灭活酶：1)−内酰胺酶(最大的一类)2)氨基甙钝化酶等2.靶位改变:PBP的数量或结构改变3.低通透性屏障作用1)膜通透性下降2)生物被膜4.主动泵出(activeefflu

xprocess)5.细菌缺乏自溶酶，对抗菌药物产生耐受2023/3/21蛋白通道：绿脓杆菌、克雷伯菌属、在细菌细胞外膜，不同药物有各自不同的通道，药物通过时通道可关闭。脂多糖细胞外膜、细胞壁细胞膜OprD2000405chmjampc8绿脓杆菌药物渗

透屏障耐药天然对抗生素的通透性降低，比大肠杆菌的抑菌浓度高数十或数百倍：大肠杆菌绿脓杆菌庆大<14-8吡肟0.121–8环丙0.010.25-2外膜蛋白高频突变，抗生素屏障作用增强2023/3/21主动外排作用(反泵作用)：将范围极

其广泛的结构不相关的抗生素或其他有毒物质排出细胞外，以减少药物在细胞周质的积累，从而使细菌产生固有耐药性。1.经典:细胞质细胞周质2.穿过细胞内膜及外膜2细胞外膜、细胞壁细胞膜12023/3/21绿脓杆

菌有多药泵出系统，至少有17种多药泵常见4种外排系统：MexAB-OprM，MexXY-OprM，MexCD-OprJ，MexEF-OprN1.绿脓杆菌MexA（连接蛋白）,MexB（转运蛋白）-OprM（外膜通道）外排系统。药物药物细菌泵（绿脓荧光素.环

丙沙星.四环素.氯霉素。与抗生素多重耐药有关）2023/3/212.绿脓杆菌MexC,MexD-OprJ外排系统。药物药物细菌泵（-内酰胺类）2023/3/213.绿脓杆菌MexE,MexF-OprN外排系统。药物药物细菌泵（与抗生素多重耐药有关）0

00405chmjampc13绿脓杆菌外膜泵的表达和抗生素的耐药性菌株泵MIC(ug/ml)PAMMexABMexBCMexEFLevoFepCpoCarbAztr1275---------0.030.1

250.250.50.251020(wt)+------0.1250.516421032+++------144256161438++++++---2.0416256162281+++----+++4-844256162303+++++++++4-848

1288ModifiedfromLeeet.alJ.Bacteriol20002023/3/21生物膜形成：绿脓杆菌克雷伯菌属•细菌形成黏液样物质（藻酸盐）保护细菌不受药物作用且避免吞噬细胞吞噬，长期潜伏在病灶处。藻酸盐绿脓杆菌000405chmjampc15生物被膜的耐药机制1.弥散屏障2.延

缓生长3.各区域生物被膜细胞不同耐药基因的表达2023/3/21靶位蛋白的改变耐药金葡、耐药表葡、耐药肺炎链球菌的膜青霉素结合蛋白（PBPs）结构改变，并与-内酰胺药物亲合性下降。•PBPs是合成细胞壁终末阶段的酶。•MRSA:PBP2a•DRSP:PBP改变（PBP1aPBP1

bPBP2xPBP2aPBP2bPBP3）•敏感菌和耐药菌基因整合使之在种属间水平传播造成大流行。000405chmjampc17−内酰胺酶---最主要的灭活酶1.到目前已发现200多种；2.新的种类不断发现；3.对−内酰胺类抗生素造成威胁。0004

05chmjampc18B-内酰胺酶分类按结构功能活性棒酸[Ambler][Bush]头孢噻肟氨曲南IMP抑制A2a---++2b---++2be++++-++2br----2c---+2e++++-++.2f++++++C1++--D2d---+/-?4v---B3++-

++-000405chmjampc19针对−内酰胺酶的对策1.侧链加笨重的基因(Bulkychain)：一代→三代2.复合制剂：酶抑制剂只解决了部分问题3.发现新的抗菌药物---碳氢酶烯类等4.正确使用抗菌药物0

00405chmjampc20第三代头孢菌素代头孢菌素过度使用后过度使用后的选择作用选择作用G-G-G+G+产ESBLESBL的大肠杆菌，肺炎克雷大肠杆菌，肺炎克雷伯菌伯菌等高产高产AMPCAMPC酶的肠杆菌属菌，枸橼肠杆菌属菌，枸橼酸菌，沙雷氏菌等酸菌，沙雷氏菌等MRSAMR

SA，VREVRE，PRPPRSP对第三代，及第对第三代，及第四代头孢菌素等四代头孢菌素等耐药耐药对第三代头孢菌素及对第三代头孢菌素及酶抑制剂复合制剂酶抑制剂复合制剂耐药耐药碳青霉烯类抗生素碳青霉烯类抗生素碳青霉烯类抗生素，碳青霉烯类抗生素，第四代头孢菌素第四代头孢菌素万古霉素万古霉素000405

chmjampc21ESBLs的发现和流行1982年英国发现一株耐头孢他啶的产酸克雷伯菌，与TEM-1相比仅有一个氨基酸的差异1983年德国发现首例ESLBs的臭鼻克雷伯菌(SHV-2)，与SHV-1相比，仅有一个氨基酸的差异1992年法、英、葡医院分离

出的KP中有14%~16%产ESBL，而在EC中的比例仅为0.1%000405chmjampc22ESBLs的发现和流行•1992~1996，美国一医院的EC和KP的检出率分别为1%和4%；1996年另两家医院ESBL的检

出率分别是35%和42%•ESBL除南极洲外均有发现。欧洲以TEM-3为主，美国以TEM-10,12,16为主，而SHV-2,5似乎世界内流行•1997年瑞士发现SHV亚型•韩国报道存在产SHV-11,2的细菌•90年代以来，已成为全球性问题000405chmjampc23ESBL

s的发现和流行香港：−90年：ECO(1.6%)KL-(2.8%)EN-(24.1%)−95年：ECO(2.6%)KL-(10.8%)EN-(22.7%)广州：−95年：ECO，KPN(5%，ICU，默沙东)−96年：ECO(18

%)KPN(19%)EN-(16%)−98年：ECO(40%)KPN(38%)EN-(38%)2000年后？000405chmjampc24•北京：CTX-M-3，11•上海：CTX-M-3•广州：CTX-M-3，11•杭州：CTX-M-3，9，13，1

4，15，22中国ESBL的主要基因型000405chmjampc25ESBL基本概念细菌一旦产生此类酶，临床上对所有青霉素类、头孢类和单酰胺类抗生素耐药，而对碳青霉烯类和头霉烯类较为敏感对酶抑制剂敏感000405chmjam

pc26ESBLs的基本概念主要由克雷伯菌和大肠埃希菌产生；为丝氨酸蛋白酶衍生物，水解−内酰胺环体外试验：对三代头孢和氨曲南抑菌环缩小，但不一定在耐药范围加入克拉维酸可使抑菌环扩大临床对−内酰胺类耐药，对碳

青霉烯类和头霉烯类药物敏感由质粒介导，往往由普通的−内酰胺酶基因(TEM-1、TEM-2、SHV-1)突变而来，能水解氧亚氨基-b-内酰胺抗生素，目前已有1百多种，多重耐药000405chmjampc27ESBLs的靶抗生素头孢泊肟(cefpodoxime

)(CPD)*安曲南(aztreonam)(ATM)头孢他啶(ceftazidime)(CAZ)头孢噻肟(cefotaxime)(CTX)头孢曲松(ceftriaxone)(CRO)000405chmjampc28ESBLs的代表性菌株大肠埃希菌肺炎克雷伯菌粘质沙雷菌弗劳

地枸橼酸菌阴沟肠杆菌铜绿假单胞菌等000405chmjampc29广谱酶(TEM-1，TEM-2，SHV-1)主要灭活青霉素和窄谱头孢菌素(一、二代头孢)，三代头孢菌素对其稳定ESBLs能分解三代头孢(头孢噻肟、头孢他啶、头孢哌酮、头孢曲松)以及单环酰胺类的氨曲

南，但大多数产ESBLs菌株对复合制剂(如特治星、舒普深)敏感，几乎所有产ESBLs菌株对泰能敏感产ESBLs菌株的耐药特点000405chmjampc30头孢他啶可以选择出产生ESBLs的菌株−产生ESBL的病人53%曾经在前一个月使用过头孢他啶−在ESBL爆发流行之前头孢他啶的

用量是以前的六倍−头孢他啶治疗中性粒细胞减少性发热的儿科肿瘤病房发生ESBL爆发流行AnnInternMed1993选择产生ESBLs的危险因素000405chmjampc31ESBL基因型已经发现了150多种TEM65SHV3

8OXA15CTX-M23其他型10000405chmjampc32产ESBL的大肠杆菌、克雷伯菌的敏感性*抗生素大肠杆菌克雷伯菌属ESBL(+)ESBL(-)ESBL(+)ESBL(-)菌株数7117244106泰能100100100100美唑88929486

西叮70838660他啶76959097吡肟89948897氨曲南9932190噻肟191089曲松293093*数据来源于协和医院ddstmethod000405chmjampc33产ESBL大肠、克雷伯的敏感性*（%）•抗生素Eco.Kp

n•ESBL(+)ESBL(-)ESBL(+)ESBL(-)•菌株数7117244106•阿米85948299•舒普深19944295•派拉035063•特治星56897991•特美叮7632083•环

丙20447586*数据来源于协和医院000405chmjampc34ESBLs检测、判断和临床辨认000405chmjampc35ESBLs检测的原理和方法ESBLs能水解三代头孢及氨曲南酶抑制剂能抑制ESBLsESBLs的检测方法双纸片法、三维试验法、肉汤稀释法、

Vitek-AMS法、E-test法、抑制剂增强的纸片扩散法和肉汤稀释法000405chmjampc36DefinitionbyNCCLSin2001•Diminishedzones,whichshouldbesuspectedofharboringanE

SBL,around:–Ceftazidime≤22mm，–Cefpodoxime≤22mm,–Aztreonam≤27mm–Cefotaxime≤27mm，–ceftriaxone≤25mm•Thesezonediametershouldincr

easeinthepresenceofclavulanicacid000405chmjampc37查K.Pneumoniae,K.oxytoca&E.coli菌中的ESBLs（初步筛选法)•培养基：CAMHB•抗生素浓度：琼脂内–头孢泊肟

1ug/mlor–头孢他啶1ug/mlor–氨曲南1ug/mlor–头孢噻肟1ug/mlor–头孢曲松1ug/mlor•使用2种以上的抗生素可以提高检测的敏感性000405chmjampc38第1级方法000405chmjampc39产ESBL大肠、克雷伯的敏感性*（%）进

一步分析•双纸片协同法:–圆心间距离：•20mm•25mm•30mm距20~30mmCTXAugmentin000405chmjampc40产ESBL大肠、克雷伯的敏感性*（%）进一步分析•纸片确证法–CAZ，CAZ+Clav–CTX，CTX

+ClavCTXCTX+Clav两圈差距>=5mm814000405chmjampc41第2级方法000405chmjampc42产ESBL大肠、克雷伯的敏感性*（%）进一步分析•MIC确证法–加棒酸后MIC降低8倍,16/2＝8.12.25.512481632ug/ml＝

不长＝长000405chmjampc43Etest法(头孢噻肟+克拉维酸噻肟)1：8头孢噻肟+克拉维酸噻肟MIC=0.5MIC=4.0000405chmjampc44第3级方法000405chmjampc45鉴定大肠杆菌及肺炎克雷伯菌中的beta-内酰胺酶的流程Sa

nders,AAC，1999，43(6):1393-1400.MIC值(ug/ml)产酶类型噻肟噻肟/棒酸曲松曲松/棒酸临床验证非ESBL<222/22OBL非ESBL>2<0.51/36ESBLESBL>2降>8倍36/36ESBL.>2>0.5降>8倍36/

36ESBL000405chmjampc46鉴定肠杆菌、枸橼酸杆菌中的beta-内酰胺酶的流程Sanders,AAC，1999，43(6):1393-1400.MIC值(ug/ml)临床验证产酶类型头孢曲松曲松/棒酸其他B-内酰胺酶<

=414/15非ESBLESBL>8降>8倍15/16ESBL000405chmjampc47ESBLs的辩认:耐药性特点肠杆菌科细菌，尤其大肠,克雷伯菌对一个或多个三代头孢敏感性下降常伴有氨基甙,喹诺酮协同耐药

头孢呋新耐药酶抑制剂,头孢西丁部分有效亚胺培南敏感临床治疗效果不好000405chmjampc48ESBLs的治疗对策(1)头孢菌素：(1)三代头孢菌素：CTX和CAZ耐药率高.(2)四代头孢菌素：耐药率不很

高，对部分ESBLs（如CTX型）稳定。000405chmjampc49ESBLs的治疗对策(2)头霉素类和碳氢霉烯类：ESBLs虽然不能水解头霉素FX，但MIC90值为≥256g/ml，耐药率为16%，可能是由于细菌外膜孔蛋白的缺失造成的。所有产ESBLs和非产ESBLs细菌对I

P敏感，证实了碳氢霉烯类是目前对产ESBLs细菌最稳定的−内酰胺抗菌药物。000405chmjampc50ESBLs的治疗对策(3)含酶抑制剂的复合制剂：耐药率较低，分别为8%和2%，但中度敏感率较高，分别为2

2%和28%，可能是这些细菌同时产生一定量的TEM-1和SHV-1而造成对复合制剂耐药程度的增加。在用复合制剂来治疗产ESBLs细菌感染时需适当增加剂量。近年来对酶抑制剂耐药的ESBLs的出现对复合制剂构成威胁，需开发新抑制剂。000405chmjampc51E

SBLs的治疗对策(4)喹诺酮类和氨基糖甙类产ESBLs细菌对AK的耐药率达42%，对CI的耐药率更高，达70%，说明这两类药物不适于产ESBLs菌株感染的治疗，除非有药敏资料证实是敏感的，且只能联合用药。000405

chmjampc52ESBL(＋)菌株的治疗建议加酶抑制剂的复合药：哌拉西林/三唑巴坦头孢哌酮/舒巴坦严重感染碳青霉烯类：美罗培南，亚胺培南头孢吡肟和头孢他啶体外显示敏感，国外证明头孢吡肟临床疗效和细菌清除率>80%，数据2003年NCCLS将修改。三代头孢菌素、头霉素类是不安全的，不适于

产ESBL菌株感染的治疗；阿米卡星和环丙沙星不适于产ESBLs菌株感染的治疗，尤其是环丙沙星，除非体外药敏实验证明是敏感的000405chmjampc53ESBL的临床预后高死亡率在一项儿童肿瘤患者的研究中，由产ESBLs细菌所致的感染引起或直接导致了15%的患者死亡。在一次医院内爆发流

行，在可提供治疗及预后资料记录的患者中的初步死亡率达53%高比例持续性定殖在一群已定殖产ESBL菌株数月的儿童肿瘤患者中，重新筛选检查发现其中60%患者持续出现无症状性细菌尿000405chmjampc54•AmpC酶由ampC基因编码产生，ampC基因表达同时受ampD，ampR，ampG

等多种基因调控，是头孢菌素酶的代表酶，属于染色体Bush1型酶或AmblerC类酶。•常见的易产AmpC酶的细菌：–阴沟肠杆菌，产气肠杆菌–粘质沙雷菌–弗劳地枸橼酸杆菌,摩根摩根菌–绿脓杆菌什么是AmpC酶？000405chmjampc55•AmpC酶水解以下抗生素

：•青霉素类耐药•头霉素类耐药•1,2,3代头孢菌素类耐药•单环类耐药•加酶抑制剂复合药（克拉维酸，舒巴坦，他唑巴坦）耐药•可分为诱导型，结构型和质粒型。什么是AmpC酶？000405chmjampc56头孢菌素酶诱导型+-AmpR激活子ampC激活转录AmpC-lactam

asPBPsAmpG感受器或跨膜转运阻断细胞壁五肽交联桥（肽聚糖片断）中间产物（配体）AmpD循环利用内膜外膜000405chmjampc57+-AmpR激活子ampC激活转录去阻遏持续高产或高度诱导型

AmpC-lactamasPBPsAmpG阻断细胞壁五肽交联桥（肽聚糖片断）中间产物缺陷AmpD蛋白内膜外膜调节基因ampD突变头孢菌素酶结构型000405chmjampc585种抗生素对60株耐头孢他啶的肠杆

菌属和枸橼酸杆菌属的活性020406080100哌拉曲松舒普深吡肟亚胺S%000405chmjampc596种抗微生物药对109株肠杆菌属的活性药名敏感％耐药％MIC50MIC90亚胺培南10000.324头孢吡肟8960.3812头孢哌酮/舒巴坦69162

96头孢他啶64282512头孢曲松55352512哌拉西林514616512YingchunXu,MinjunChenetal.DiagnMicrobiolInfectDis1999;35:135-142000405chmjampc6014株阴沟肠杆菌耐药株对10种抗生素的

MIC（g/ml）菌株哌拉哌唑噻肟曲松他啶曲南吡肟亚培庆大1641632128128320.250.50.525126425625612812840.1250.55128641281281286442326643264

64128640.50.1250.58512642565122566440.1250.513512642562562566440.1250.514256321282561286420.1250.51825664128128

1286440.250.25191281664256128320.50.25420128322562561283220.1251235121281282562566440.25322412816128256128640.50.250.252525664128256128

6420.250.252751212825651225612840.250.25ESBLAmpC－＋－＋－＋－＋－＋－＋－＋－＋－＋－＋－＋－＋－＋－＋－＋吴伟元，陈民钧等。中国临床药理学杂志，2001,70:104-109000405chmjampc6190％的基因与阴沟肠杆菌的

AmpC同源肺炎克雷伯菌质粒介导的MIR－1酶传播水解：头孢西丁头孢他啶头孢噻肟头孢曲松1988年美国Papanicolaou质粒型AmpC酶000405chmjampc6200121817产质粒AmpC酶的

大肠杆菌敏感性（MICg/ml)*酶型噻肟他啶西丁氨曲南吡肟亚胺*CMY-1644256160.250.06*CMY-216128256640.50.06*CMY-31664128320.25*FOX-2163225620.12

0.5*FOX-3116641?0.060.12*FOX-464>128>2566420.5*LAT-112812864642*LAT-396128256640.5*LAT-4486480.125*MOX-1>51216>256160.5000405chmj

ampc63如何推测大肠杆菌和肺炎克雷伯菌产生质粒AmpC酶？头孢西丁或头孢美唑R三代头孢菌素R/I/S加酶抑制剂类R/I/S头孢吡肟S碳青霉烯类S000405chmjampc64ESBL与AmpC的差别ESBL高产AmpC质粒AmpCSSBL酶

＋膜蛋白碳青霉烯类SSSSR头孢吡肟S/I/RSSS/I/RR酶抑制复合药sRrRR三代头孢菌素R/I/sRR/I/sRR头霉菌素SRRRR主要细菌：肺克阴沟肺克大肠嗜麦芽大肠枸橼酸大肠肺克鲍曼沙雷沙门菌绿脓绿脓000405chmjampc65肠杆菌属沙雷菌属枸

橼酸菌属等的治疗建议产诱导型AmpC酶：头孢吡肟,头孢哌酮-舒巴坦，哌拉-他唑巴坦,头孢他啶,碳青酶烯类,氟喹诺酮类产结构型AmpC酶：头孢吡肟，碳青酶烯类，氟喹诺酮类产ESBL：碳青霉烯类，哌酮-舒巴坦,哌拉-他唑巴坦,头孢吡肟（CTX

-M）产SSBL：碳青酶烯类，头孢吡肟，氟喹诺酮类?000405chmjampc66PIP/TAZ综合分析•PIP/TAZ属β-内酰胺/酶抑制剂复合类抗生素，在广谱、抗假单胞菌青霉素哌拉西林的结构中加上了酶抑制剂他唑巴坦，对细菌产生的广谱和超广

谱β-内酰胺酶稳定。•抗菌谱较广，可覆盖革兰阴性菌肠杆菌科、非发酵细菌、厌氧菌和粪肠球菌。000405chmjampc67PIP/TAZ综合分析•对革兰阴性菌总体及产生ESBLs的细菌（大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌）而言，PTZ的敏感率稍低于IM

P，但优于AMK、CSL和第三代头孢菌素。对非发酵细菌中最主要的铜绿假单胞菌有很好的体外活性，甚至高于碳青霉烯类。•用PIP/TAZ替代三代头孢，不引起肠道菌群失调（CD）和耐药菌株（VRE、MRSA、ESBLs等）定植。000405chmjampc68对三代头孢不敏感的细菌临床

策略G-ESBLsIMP，PTA，CSL，AMK，FOXAmpCIMP，FEP，AMKPAEPTA，AMK，CAZ，IMPABAIMP，CSLXMASXT，TCC，CIPG+MRSVANC，TECVREAMP，PTA+GEN，TEC000405c

hmjampc69