抗肝损伤和肝纤维化药实验法培训课件

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以下为本文档部分文字说明:

抗肝损伤和肝纤维化药实验法•肝脏的细胞:实质细胞(肝细胞)及非实质细胞(肝星状细胞\枯否细胞\pit细胞\窦内皮细胞)•Pit细胞-大颗粒淋巴细胞-位于肝血窦内的Nk细胞。2抗肝损伤和肝纤维化药实验法第1节急性肝损伤动物模型作用:筛选

改善肝细胞损伤的药物并评价其活性主要内容:1.四氯化碳肝损伤动物模型2.急性氨基半乳糖肝损伤动物模型3.急性对乙酰氨基酚肝损伤动物模型4.急性乙醇性肝损伤动物模型5.大鼠肝缺血-再灌注模型3抗肝损伤和肝纤维化药实验法1.四氯化碳肝损伤动物模型【原理】1)CCL4对肝细胞膜直接溶解作用。2

)活性代谢产物对肝细胞的损伤。CCL4在肝细胞内质网中经细胞色素P450酶的代谢,生成活泼的三氯甲基和氯自由基。①与细胞内和细胞膜的大分子发生共价结合,膜脂质过氧化,膜的结构和功能完整性被破坏;②抑制细胞膜及线粒体膜上钙泵的活性,胞浆

[Ca2+]升高,Ca2+-ATP酶激活,ATP耗竭导致肝细胞损伤坏死。4抗肝损伤和肝纤维化药实验法动物:以大鼠使用最多,雌雄兼用,280g左右。方法:大鼠一般以CCL4原液1ml/kg体重一次性ip或sc注射。也可经ig给药,0.8-1.6ml/kg,配成1:1~1:3橄榄油或精制花生油

稀释后ig。小鼠对CCL4亦较敏感,配成1%橄榄油或精制花生油稀释液,按10-20ml/kgig或ip注射。观察指标:1.给CCL4后16-24h处死动物,测定血清ALT和AST(↑)变化,甘油三酯(GT↑)、乳酸脱氢酶(LDH↑)、总胆酸(TBARS

↑)及肝指数升高,谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px↓)(检测试剂盒)。2.肝病理形态学检查。5抗肝损伤和肝纤维化药实验法【注意事项和评价】(1)此模型是一种经典的实验性肝损伤模型。形态学上主要表现为肝小叶中央区坏死和脂肪变性,转氨酶ALT和AST升高,并能灵敏地反映肝损伤的程度。ALT和A

ST16-24h后达到高峰,升高十倍左右,90h后可恢复到正常范围。(2)可先给药物7-10天,以评价药物对肝损伤的保护。(3)CCL4可由呼吸道、皮肤吸收,对人体有一定的毒性,注意个人防护。6抗肝损伤和

肝纤维化药实验法7抗肝损伤和肝纤维化药实验法2.急性氨基半乳糖肝损伤动物模型【基本原理】氨基半乳糖(Galactoamine,GalN),常用其盐酸盐,生理盐水溶解。机制:GalN属间接肝毒剂,肝损伤与其在肝内的代谢及随后对核酸合成的影响有关。GalN引起

肝细胞坏死。分为三个步骤:第一步,GalN在肝内代谢引起VDP-葡萄糖胺的聚积,同时引起尿嘧啶核苷酸和UTP(尿苷三磷酸)缺乏;第二步,这些代谢异常引起肝细胞膜损伤;第三步,钙离子内流增加破坏细胞内钙稳态,

进而引起代谢紊乱,导致细胞的死亡。8抗肝损伤和肝纤维化药实验法(1)动物:大鼠,250~350g,雌雄兼用。(2)方法:将GalN以无菌生理盐水配成10%溶液,1mol/LNaOH调pH至7.0,ip一次性注射500-850mg/kg(大于1000mg/kg,引起广

泛性肝坏死)。(3)检测指标:给药16-24h处死动物,测定血清ALT(↑)和AST(↑),GT(↑)、LDH(↑)、TBARS(↑)及肝指数(↑)。肝病理形态学检查。9抗肝损伤和肝纤维化药实验法【评价】•(1)小

鼠不敏感。•(2)GalN与CCl4所致肝损伤的组织学变化显然不同。GalN损伤则呈弥漫性的多发性片状坏死,脂肪变性不如CCl4明显,嗜酸性小体较多见,与病毒性肝炎所造成的损伤类似。GalN肝毒性的专一性较佳,对人安全无毒。•GalN肝损伤模

型是研究病毒性肝炎的发病机制及其药物治疗的较好模型。10抗肝损伤和肝纤维化药实验法•3急性对乙酰氨基酚肝损伤动物模型•【基本原理】•1.大剂量对乙酰氨基酚代谢中产生大量N-乙酰-对苯醌亚胺(NAPQI),超过了GSH的解毒能力,未被清除的NAPQI与生物大分子共价结合,导致蛋白质巯基被

氧化和芳基化而影响功能。•2.对乙酰氨基酚在肝内代谢过程中产生自由基可引起肝细胞膜脂质过氧化,并通过破坏钙稳态而产生细胞毒性。11抗肝损伤和肝纤维化药实验法•【操作步骤】•(1)动物:昆明小鼠,雄性,25~35g。•(2)方法:将对乙酰氨基酚

溶于40%无菌生理盐水,一次性ip注射300-500mg/kg,24h后取血。•(3)观察指标:血清ALT和AST测定。肝作组织学检查。12抗肝损伤和肝纤维化药实验法【评价】(1)对乙酰氨基酚(扑热息痛),乙酰氨

基酚肝损伤是研究药物性肝损伤的常用动物模型。(2)对乙酰氨基酚肝损伤的组织学变化主要表现以中央静脉为中心的圆盘状大量细胞坏死,但出血和脂肪变性不如CCL4肝损伤明显。(3)大鼠对对乙酰氨基酚不敏感,小鼠十分敏感。13抗肝损伤和肝纤维化药实验法4.急性乙醇性肝损伤动物模型【

基本原理】1.大量饮酒除经醇脱氢酶(ADH)氧化外,还可诱导微粒体乙醇氧化系统(MEOS),催化乙醇产生乙醛毒性物质。2.乙醇诱导MEOS活性不但不能使乙醇氧化产生ATP,还增加氧和NADPH(还原型辅酶Ⅱ)的消耗,造成肝内能量的耗竭,引起肝细胞损害。14抗肝损伤和肝纤维化药实验法

•【试验步骤】(1)动物:雄性大鼠,180~220g。(2)方法:ig56度白酒,7ml/kg,每日2次。1~2周后表现为肝细胞脂肪变性,伴轻度气球样变和炎细胞浸润。(3)检测指标:1.给CCL416-24h处死动物,测定血清ALT和AST(↑)变化,甘油三酯(GT↑

)、乳酸脱氢酶(LDH↑)、总胆酸(TBARS↑)及肝指数升高,谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px↓)。(检测试剂盒)肝病理形态学检查。15抗肝损伤和肝纤维化药实验法【注意事项与评价】•灌胃法造模符合人类饮酒习惯。•用于酒精性肝损伤药物筛选。16抗肝损伤和肝纤维化药实验法5.大鼠肝缺血-再灌注模

型【基本原理】•暂时阻断肝血流,一段时间肝细胞并无明显损伤,但随后再灌注反而出现损伤。发生严重缺血性损伤的细胞,再灌注不能使损伤减轻,反而使之加重。•再灌注损伤的因素主要与自由基损伤和细胞内Ca2+超

载有关。17抗肝损伤和肝纤维化药实验法•缺血时,ATP大量分解,依次生成AMP→腺苷→次黄嘌呤→黄嘌呤。黄嘌呤在黄嘌呤脱氢酶的作用下,经非氧化的途径进一步分解而生成尿酸。•再灌时,由于细胞内Ca2+突然增加,激活某种蛋白酶,使黄嘌呤脱氢酶转变为氧化酶,同时由于再灌注增加了氧的供应,

黄嘌呤便在黄嘌呤氧化酶的作用下,通过有氧氧化途径生成尿酸,并生成大量氧自由基、羟自由基(OH)和H202。自由基和生物大分子作用,可使之受损。同时由于肝细胞内Ca2+超载,使细胞膜及细胞器受损,细胞出现能量障碍。18抗肝损伤和肝纤维化

药实验法【操作步骤】•(1)动物:大鼠,200~250g,♂。•(2)方法:戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉大鼠。打开腹腔,分离肝门静脉、肝动脉和胆总管,用小型动脉夹将三者一同夹闭30一60min后,松开动脉夹让血液重新灌注。•(3)观察指标:分别于再灌流30min和60min取静脉血测定血清

ALT和AST活力。取肝组织,测定MDA含量。19抗肝损伤和肝纤维化药实验法第2节小鼠免疫性肝损伤模型20抗肝损伤和肝纤维化药实验法•1.LSP诱发的小鼠自身免疫性肝炎【基本原理】肝细胞膜特异性脂蛋白(LSP)是一组大分子肝细胞膜脂蛋白抗原。乙型

病毒性肝炎患者血清中抗LSP持续阳性。LSP是器官特异而非种属特异。小鼠LSP-1与兔肝细胞有交叉抗原性,故用兔LSP反复免疫小鼠,可以引起机体产生高滴度的抗LSP抗体。同时辅以人乙型肝炎疫苗等刺激,可诱发小鼠自身免疫性肝炎。21抗肝损伤和肝纤维化药实验法•【操作

步骤】‘(1)分离LSP:日本大耳兔,放血处死,取肝,用pH8.0的蔗糖溶液制成50%(w/v)的肝匀浆,4℃,105000×g离心1h,取上清液过分离柱,收集第1峰,浓缩、透析,即取得LSP;测定蛋白含量,置-20C,备用。•(2)制作自身免疫性肝炎模型:C57BL小鼠,雌性

,20±2g,用兔LSP(0.5mg/ml)加等量弗氏不完全佐剂和人乙型肝炎疫苗(0.25ug/m1),sc0.1ml,每周一次,于第4次免疫后第7天处死,检测血清抗LSP滴度和肝组织学变化。•(3)血清抗LSP测定

:采用ELISA方法.22抗肝损伤和肝纤维化药实验法【注意事项与评价】•LSP是一种弱抗原,不能诱发明显的肝损伤。同时辅以人乙型肝炎病毒刺激,则可促进自身免疫性肝炎的产生。23抗肝损伤和肝纤维化药实验法2.卡介苗+脂多糖诱导小鼠免疫性肝损伤【基本原理】预先给小鼠注射卡介苗(BCG),

可使多核中性粒细胞或巨噬细胞聚集于肝,继后再用低剂量大肠杆菌脂多糖(LPS)攻击注射,可激发这些细胞释放对肝细胞有毒性作用可溶性因子,造成免疫性肝损伤。24抗肝损伤和肝纤维化药实验法【操作步骤】昆明种小鼠,雌性,24

±3g。NS配制卡介苗溶液,每108活菌/ml,尾静脉0.2ml。2h后ig给药或溶媒,连续12d。12d后尾静脉注入LPS(7.5ug/0.2ml)。禁食12h。称体重,摘眼球取血,离心(250×g,20m

in),收集血清,测ALT、AST。另取:(1)肝脏、胸腺,称重,计算肝和胸腺指数;(2)肝左叶送病理组织学检查;(3)每组取3只鼠,体外检测脾细胞的ConA增殖(4)检测腹腔巨噬细胞分泌TNF与IL-1等。25抗肝损伤和肝纤维化药实

验法•【注意事项与评价】•(1)每批卡介苗所含活菌数有所差异,实验前应做活菌数的检测。•(2)由于卡介苗活菌数检测不精确,且容易造成污染,可用灭活的短小棒状杆菌(CP)替代。选模型方法是:给小鼠iv0.5-1mgCP,9天后iv

10ugLPS,12-16h后处死动物,采集血和肝脏标本进行检测。26抗肝损伤和肝纤维化药实验法•3.鸭乙型肝炎病毒性肝损伤动物模型【基本原理】由于受人乙型肝炎病毒(HBV)宿主专一,需寻找类似于HBV的其它动物肝炎病毒以用于研究。鸭乙型肝炎病毒(DHBV)与HBV同属于嗜肝DNA病毒科,

因此DHBV感染的鸭可用于研究HBV致病机制和筛选抗肝炎病毒药物的研究。27抗肝损伤和肝纤维化药实验法•【操作步骤】•(1)DHBV毒种获取:从自然感染DHBV阳性的成年家鸭取血清,测定其DHBV滴度,根据与定量克隆DHBVDNA比较,计

算每ml血清所含的病毒颗粒数,分装在-70℃保存。•(2)实验用鸭:选血清斑点杂交试验DHBVDNA阴性的北京雏鸭(1-3天内)。•(3)感染方法:接种病毒量在5×108/ml(血清稀释)。ip给予血清0.5ml。•(4)观察指标:30日后处死,检测血清和肝组

织DNA提取物的DHBVDNA。28抗肝损伤和肝纤维化药实验法•【注意事项与评价】•(1)鸭种来源:不同鸭种对DHBV的易感程度有所差异,北京鸭对DHBV易感。•(2)DHBV接种时机:鸭胚孵化1-5天内的雏鸭及5天后的小

鸭或成年鸭。接种时鸭龄越大,感染维持的时间即越短,但鸭胚时期接种病毒技术要求很高,雏鸭的孵出率难控制,故多认为孵出后l~3天内(多选择24h内)接种病毒时机最佳。•(3)接种途径:DHBV接种途径包括:iv,ip,im,肝内注射il,胚内注射ie等。一般认为,在其它条件相同的条件下,ip,iv

,ie接种感染率最高,im接种次之,最可靠的方法可能为ip、il。29抗肝损伤和肝纤维化药实验法••(5)感染DHBV鸭肝炎的评价:理想的感染DHBV鸭肝炎模型应具备:血清中有持续稳定的病毒症即DHBVDNA(+),鸭肝内

应有DHBVDNA或(和)DNAP。感染了DHBV的家鸭其血清DHBVDNA和DHBVDNAP的水平在整个持续感染期间有很大的波动性,甚至可以出现暂时的转阴现象,但此时肝组织DHBVDNA的检测仍能够

显示出乙肝病毒的感染状态,因此,肝组织病毒DNA的检测比血清病毒DNA的检测更具重要性,更能可靠地反映出病毒感染的真实情况。30抗肝损伤和肝纤维化药实验法•4.刀豆蛋白A诱导小鼠急性免疫性肝损伤模型【基本原理】刀豆球蛋白A(ConA)是植物性蛋白的一种。给小鼠静脉注射ConA后,可激活T淋巴

细胞,导致与人类自身免疫性肝炎相似的肝损害。ConA进入小鼠体内后可使肝脏中NO合成酶及TNF-α、INF-γ表达增高,而TNF-α和INF-γ可激活iNOS系统,从而使NO合成增加导致肝损伤。31抗肝损伤和肝纤维化药实验法•【操作步骤】(1)动物:7~9周龄小鼠,体重18~25g。(

2)方法:ConA溶解于生理盐水中,以10~30mg/kg的剂量(0.3ml)一次尾静脉注射。(3)观察指标:ConA注射后24小时取小鼠血清和肝脏,测定小鼠血清中ALT和AST活力,并取肝作组织学检查。【注意事项】多数小鼠对ConA敏感而发生自身免疫性肝炎,但免疫缺陷小鼠和无胸腺裸鼠对ConA不

敏感。32抗肝损伤和肝纤维化药实验法第3节脂肪性肝病•脂肪性肝病包括乙醇性肝病和非乙醇性脂肪性肝病。研究其发病机制、评价诊断方法、筛选防治该病的有效药物的理想动物模型应具备:•1)人类脂肪性肝病的特征;•2)病变有一定发展过程,从单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纤维化至最终的肝硬化

有相对明显的分期,符合人类脂肪肝的演变过程;•3)简便易行,模型形成率高,死亡率低;•4)造模停止后病变逆转缓慢,便于药物干预试验。33抗肝损伤和肝纤维化药实验法一、高脂饲料诱发的脂肪肝【基本原理】脂肪肝

的发病主要为:进入肝内的脂肪酸过多,TG的合成超过将其转运出肝脏的能力;肝内脂肪酸氧化障碍,利用减少,TG合成增加;VLDL的合成及分泌障碍,肝脏内源性TG不能运出;脂蛋白代谢酶的活性下降等。【操作步骤】(1)动物:SD大鼠,雄性,200~250g。(

2)方法:每日ig高糖、高脂、高蛋白乳剂,乳剂组成见表(略),实验开始1~4周乳剂ig2.5、5、7.5、10ml/kg每周递增,后2周持续10ml/kg,共6周。(3)观察指标:检测血清ALT、AST、TG、HDL-C、LDL-C(低密度脂蛋白-胆固醇)、TG含量肝组织作病理组织学检查。3

4抗肝损伤和肝纤维化药实验法【注意事项与评价】•(1)加入与猪油等量的植物油,更符合人类的膳食结构,植物油富含多不饱和脂肪酸,易发生过氧化反应,产生自由基和醛类物质,醛类物质可与抗谷胱甘肽等抗氧化剂的活性部位结合,减少对自由基的清除,引起二次攻击的发生。•(2)6周后,大鼠出现

弥漫性脂肪变性,肝细胞体积增大,胞质内充满大量脂肪空泡。部分造模动物甚至有轻至中度肝实质炎症,即成功复制出肥胖、高脂血症、脂肪肝,甚至脂肪性肝炎模型。35抗肝损伤和肝纤维化药实验法二、低蛋白、乏胆碱高脂饮食脂肪性肝炎模型【基本原理】饲料中缺乏蛋白质不能合成载脂蛋

白,以致甘油三酯积存肝内;胆碱缺乏引起磷脂酰胆碱合成不足,从而导致极低密度脂蛋白合成下降,无法将甘油三酯运出肝外,引起肝内脂肪堆积,形成脂肪变性。【操作步骤】(1)动物:大鼠,雄性,200~250g。(2)方法:缺乏蛋氨酸

和胆碱的饲料喂大鼠。饲料配方成分:蔗糖360g、右旋麦芽糖200g、猪油250g、植物纤维素50g、玉米粉50g、食盐7.5g、黑豆30g、CaCO32.5g、MgO1.5g、维生素A15000U、维生素D21500U、维生素E0.5g

。(3)检测指标:进行肝病理形态学检查。36抗肝损伤和肝纤维化药实验法【注意事项与评价】(1)第8天肝细胞内有少量脂滴,第14天约1/3肝细胞含有细颗粒状脂滴,第21天约2/3以上肝细胞内出现脂滴,第28天可见肝

细胞内充满脂肪空泡。(2)此种模型与人类脂肪性肝炎改变相类似,但其造模方法与人类膳食情况不同,人类与啮齿类动物不同,其肝脏不存在胆碱缺乏问题。37抗肝损伤和肝纤维化药实验法三、乙醇灌胃动物模型•【基本原理

】乙醇在乙醇脱氢酶的催化下脱氢氧化,使三羧酸循环障碍和脂肪酸氧化减弱。乙醇可致磷酸甘油增多而促进甘油三酯合成,致使脂肪在肝细胞内沉积;同时乙醇能激活氧分子,产生氧自由基导致肝细胞膜的脂质过氧化及体内还原型谷胱甘肽的耗竭;乙醇对CYP2

E1的诱导可加重乙醇代谢产物的肝毒性,使肝脏内皮细胞窗孔改变,导致肝细胞脂肪摄取增多,促进脂肪肝的形成。•【操作步骤】•(1)动物:大鼠,雄性,150~170g。•(2)方法:灌服50%(V/V)乙醇10ml/kg,每日2次,同时以10%的乙醇为唯一饮料。•(3)检

测指标:14周后处死动物,进行肝病理组织学检查。•【评价】造模14周出现肝细胞脂肪变及乙醇性肝炎样改变,可见肝脏间质反应性增生。38抗肝损伤和肝纤维化药实验法四、高脂饮食+乙醇灌胃动物模型【基本原理】•高脂饮食可导致脂肪

代谢异常;•乙醇所造成的脂肪在肝脏中的堆积主要由于乙醇及其氧化产物与肝内脂质代谢的相互作用,乙醇以及活性氧在线粒体损伤中起主要作用。•可能因素:•①游离脂肪酸(FFA)输送入肝增多;②肝脏合成FFA增加或TG合

成增多;③FFA在肝线粒体中的氧化减少;④肝脏分解脂肪的能力下降;⑤极低密度脂蛋白(VLDL)合成和分泌减少,致肝脏输出TG的能力下降。39抗肝损伤和肝纤维化药实验法【操作步骤】(1)动物:大鼠,雄性,200~220g。(2)方法:以乙醇+脂肪乳剂灌胃,bid,6

周。造模前3天以30%(v/v)乙醇5g/(kg·d)适应性灌胃,自第4天起,每3天乙醇的浓度增加5%,剂量增加0.6g/(kg·d),至乙醇浓度55%,剂量8g/(kg·d)止。脂肪乳剂灌胃量10ml/(kg·d)不变。(3)观察指标:第6周末,麻醉,腹主

动脉采血,取肝脏相同部位,制备肝匀浆,进行病理组织学检查。检测血清ALT、AST、ALP、TG、SOD、MDA、GSH-PX及肝匀浆TG、SOD、MDA、GSH-PX含量。【评价】6周后,大鼠出现典型脂肪肝病变:肝细胞肿胀,细胞内充满大小不一的脂滴。40抗肝损伤和肝纤维化药实验法第4节肝纤维

化动物模型•肝纤维化是肝细胞发生坏死及炎症刺激时,肝内纤维结缔组织异常增生的病理过程,它是慢性肝病重要的病理特征,也是进一步向肝硬化发展的主要中间环节。•理想的动物模型应当是:①与人类疾病特征相似;②病变有一定的发展过程,即有明显的肝纤维化形成过程的分

期;③形成率高,死亡率低;④造模方法简便易行。41抗肝损伤和肝纤维化药实验法常用的肝纤维化动物模型1.CCl4诱发的肝纤维化模型【基本原理】四氯化碳(CCl4)在肝P450酶作用,形成三氯甲基自由基和氯自由基,启动脂质过氧化作用,损伤肝细胞。长期反复多次给予CCl4,可致肝内纤

维增生,并逐渐加重形成肝硬化。42抗肝损伤和肝纤维化药实验法•【操作步骤】(1)实验动物:大鼠,雄性,100-150g。(2)造模方法:将CCl4与橄榄油或精制花生油按l:l比例配比。按CCl41ml/kg,ig2次/周,持续10周。(3)

观察指标:检测血清总胆红素、总蛋白、Ⅳ型胶原,Ⅲ型前胶原肽以及肝羟脯氨酸含量;肝组织作HE染色和胶原纤维染色的病理组织学检查。43抗肝损伤和肝纤维化药实验法•【评价】(1)灌胃法优点在于CC4可直接经门静脉到达肝,1.5h肝内即可达最高水平,故宜采

用这种给药途径。(2)方法改进:单纯CCl4造模方法简单,但时间较长。改用ccl4+苯巴比妥的方法(诱导药酶),缩短实验周期。动物在饮用苯巴比妥(35mg/d),2周后,灌胃CCl4,开始剂量为0.04ml,以后按体重调整CCl4用量,1次/周。用此

方法缩短时间,早期肝纤维化4-6周形成,8-10周形成肝硬化。是目前常用的方法。44抗肝损伤和肝纤维化药实验法•2.异种血清诱导的免疫性肝纤维化模型【基本原理】慢性肝病迁延不愈的本质与免疫反应有关。异种血清作抗原,反复注射动物,在体内形成抗异

种血清蛋白的抗体,通过免疫复合物的形成而造成肝免疫反应,激发肝内静止的贮脂细胞向肌成纤维细胞转化,并分泌胶原,导致肝纤维化。45抗肝损伤和肝纤维化药实验法【操作步骤】•(1)血清蛋白皮下致敏阶段:雄性大鼠,120-150g。将人血白

清蛋白用生理盐水稀释,与等量的不完全弗氏佐剂乳化。大鼠皮下多点注射,每次注射0.5ml(内含清蛋白4mg),共4次。前2次间隔14天,第3、4次间隔10天。末次致敏后10天,从大鼠尾静脉抽血1ml,用间接ELISA法测定血清抗人血白清蛋白抗体,取抗体阳性大鼠实验。•。46

抗肝损伤和肝纤维化药实验法(2)血清蛋白尾静脉攻击阶段:大鼠经尾静脉注射白蛋白,2次/周。第1周注射剂量为2.5mg/只,以后每次攻击增加0.5mg,直至4.5mg,维持此剂量,至少2个月。【注意事项与评价】(1)致敏结束后,选择抗人血清清蛋白抗体阳性的大鼠作实验。(2)攻击阶段中所用血清蛋白

的剂量影响模型形成时间和死亡率,增大血清蛋白剂量,可使实验周期缩短,但增加动物的死亡率。47抗肝损伤和肝纤维化药实验法•3.猪血清诱导的免疫性肝纤维化。•方法:•新鲜猪血,350×g离心20min,制得血清,滤过除菌,-20℃保存。•Ip猪血清0.5ml(约含30mg

蛋白质),每周2次,共8周。•该方法简便,实验周期较短。注射猪血清4周即见肝内胶原纤维形成纤维束,8周后纤维化的动物数增多,第12周,即停止注射猪血清4周后,仍有明显的纤维间隔存在,分割肝小叶形成假小叶。48抗肝损伤和肝纤维化药实验法•4.胆总管结扎致肝纤维化(肝硬化)动物模型•【基本原理】•肝

外或肝内胆管梗阻导致继发性胆汁性肝硬化。采用胆总管结扎,在狗、大鼠、兔、猴等动物中制作出实验性继发性胆汁性肝硬化模型。•主要用于肝硬化的血流动力学研究。49抗肝损伤和肝纤维化药实验法•【操作步骤】•(1)动物:杂种狗,12-21kg。•(2)实验方法:无菌上腹正中切口,抬高肝缘,

拉开十二指肠,分离胆总管2-3cm,穿刺抽出胆汁为准。在近十二指肠处和近胆囊处用4号丝线各结扎两道,从中切断胆总管。•肌注青霉素80万u/天,3天,防感染。50抗肝损伤和肝纤维化药实验法•(3)血流动力学检查:结扎10周后,禁食12h。戊巴比妥钠静脉麻醉(25mg/kg

),分别插入导管:•①经股动脉插管监测平均动脉压(MAP)及心率(HR);•②经股静脉插管至下腔静脉监测下腔静脉压(ICVP);•③经肠系膜静脉插管至门静脉。测门静脉压(Ppv);④经右颈外静脉插管至肝静脉,测定肝静脉压(FHVP),嵌

塞肝静脉压(WHVP)及肝静脉压力梯度(HVPG)。51抗肝损伤和肝纤维化药实验法【注意事项与评价】(1)插管前于管内预先注入肝素防止凝血。各项指标均输入多道生理记录仪同步记录。(2)胆总管结扎肝硬化动物模型制作方法简单、周期较短。但有时胆管再

通,组织学发生逆转,胆汁过度淤积及死亡率高。52抗肝损伤和肝纤维化药实验法•5.D-GalN致肝纤维化模型动物:大鼠,150-200g,雌雄兼用。方法:(1)生理盐水配成10%的溶液,ip250mg/kg,一天一次。每周6次。(2)

5个月,肝小叶出现紊乱,增生的胆管及纤维母细胞向四周成星状伸展;(3)6个月后,肝小叶结构完全紊乱,被分割成多个小结节,周围有结缔组织包绕。【评价】溶液配制简便,但该模型亦存在周期长等不足。53抗肝损伤和肝纤维化药实验法6.乙醇诱导

的肝纤维化模型【基本原理】乙醇代谢产物乙醛对肝脏产生直接损害,其中肝脏使辅酶I(NAD)转变为还原性辅酶I(NADH),NAD/NADH比例下降使三羧酸循环受抑制,脂肪氧化减弱,肝内脂肪酸合成增多,超过肝脏处理能力,形成脂肪肝,最终形成肝

纤维化。(1)动物:大鼠,180~220g,雌雄兼用。54抗肝损伤和肝纤维化药实验法方法:以低脂肪(占总热量的7%)、高蛋白(占热量的13%),并含一定的胆碱和糖类(占热量的41%)的饲料喂养。起初3日给予大鼠2%的蔗糖溶液自由饮用,然后在2%的蔗糖溶液中加5%乙醇(v

/v),以后每隔4日提高乙醇浓度5%直至15%,其后改为每周增加5%的乙醇浓度直至乙醇的终浓度为40%。造模16周出现肝腺泡III区轻度脂肪变,25周时肝脂肪变加重,并伴有肝细胞坏死、门管区炎性细胞浸润和中央静脉周围纤维化。【注意事项与评价】(1)雌性造模大鼠肝脂肪变高于雄性,但

肝病理学改变并无性别差异。(2)通过食用固体食物和以乙醇溶液作为饮料,饮食组成比例与人类接近,与人类乙醇性肝损伤相接近。55抗肝损伤和肝纤维化药实验法7.二甲基硝胺(DMN)诱导的肝硬化【基本原理】二甲基硝胺具有肝毒

性、细胞毒性和免疫毒性,长期给大鼠可导致肝实质细胞发生广泛坏死、纤维组织蓄积、肝脏萎缩、血清蛋白浓度下降、总胆红素升高、血小板数减少等而导致肝纤维化、肝硬化。56抗肝损伤和肝纤维化药实验法【操作步骤】(1)动物:大鼠,雄性,180~200g。(2)

方法:ip1%DMN生理盐水溶液,10mg/kg,1周1次。3~4周后开始出现肝纤维化;注射5周后,肝脏有肝实质纤维化的弥散性小结节分布;第6、7周时大鼠肝酷似人的肝硬化。【注意事项与评价】(1)此模型与人类肝硬化早期改变及胶原纤维沉积相似

,可作为筛选抗纤维化药物模型。(2)此模型癌变率较高。(3)环境污染严重。57抗肝损伤和肝纤维化药实验法8.复合因素建立肝纤维化模型【基本原理】•高脂乳剂富含多不饱和脂肪酸,易发生过氧化反应产生自由基和醛类物质,加速非乙醇性脂肪肝的形成。•

而CCl4在肝内经混合功能氧化酶作用形成三氯甲基自由基,通过引发活性氧自由基的产生,启动脂质过氧化作用,导致肝细胞损伤,诱导肝纤维化产生。•富含多不饱和脂肪酸的花生油通过激活肝内脂质过氧化反应,促进CCl4引起的大鼠肝损

伤,两者协同,可加速脂肪性肝纤维化的形成。58抗肝损伤和肝纤维化药实验法•【操作步骤】(1)动物:大鼠,雄性,200~220g。(2)方法:以高脂乳剂灌胃(1次/天),同时配以40%CCl4花生油溶液1ml/kg作背部后侧皮下注射(2次/周);每天给以足量的1

8%蔗糖溶液,自由饮用。(3)检测血清ALT、AST、透明质酸、层粘连蛋白、Ⅳ型胶原、Ⅲ型前胶原肽以及肝羟脯氨酸含量;肝组织作HE染色和胶原纤维染色的病理组织学检查。59抗肝损伤和肝纤维化药实验法【评价】(1)复合因素作用于动物,可以缩短造

模时间,提高成功率。(2)6周可见肝细胞点状及点灶状坏死、汇管区炎性细胞浸润、周围纤维轻度增生等早期纤维化症状表现;8周表现出肝小叶结构破坏,肝索排列紊乱,炎性细胞浸润,间质纤维组织增生等明显的肝纤维化症状

。60抗肝损伤和肝纤维化药实验法第5节离体大鼠肝灌流方法【基本原理】离体大鼠肝灌流技术是在麻醉状态下用外科手术使肝形成体外循环,由蠕动泵将氧饱和的特定灌流液恒速压入循环管道,流经过滤装置、加温装置、门静脉套管到肝,从上腔或下腔静脉流出,流出液可取样进行分析或再流回贮液池进行再循环。在一段时间内使离

体肝维持其正常的生理和生化功能,在人工控制剂量和排除整体影响的条件下,动态地研究药物及其他化学物质在肝的代谢规律及其对肝功能的影响。61抗肝损伤和肝纤维化药实验法【实验材料】(1)灌流仪:灌流仪有以下几个组成部分:蠕动泵与医用硅橡胶管系统,贮液槽与气体交换装置,控制灌流系统的隔水式恒温装置

,可除去灌流液中破碎细胞或其他凝集物的过滤装置。(2)灌流介质:人造灌流液进行灌流。1)无红细胞的人造灌流液。2)含红细胞的灌流液。62抗肝损伤和肝纤维化药实验法【操作步骤】(1)动物及手术:大鼠,200~250g

。ip戊巴比妥钠50mg/kg,腹腔U型剪开,将腹腔内脏器移向大鼠左侧,即可见胆管及肝门静脉;先插入胆管导管,并固定;然后在门静脉近肝端与幽门静脉分支之间穿入一手术丝线,打一活套,然后插入门静脉插管,迅速固定,立即开始灌流,

打开上、下腔静脉,冲去肝内残血;将肝完整无损地分离出来,置灌流仪中灌流。双向灌流需在插入门静脉插管灌流后,结扎下腔静脉,打开胸腔,由上腔静脉插入另一套管,再分离出整个肝。2)脏器灌流:将肝移到灌流仪的脏器

托盘上,先用灌流液冲洗肝内残存血液。调整灌流速度,检查流出液速度,保持灌流液能通畅流出。63抗肝损伤和肝纤维化药实验法•第6节大鼠肝细胞原代培养实验方法【基本原理】大鼠肝细胞分离方法是在肝离体灌流技术中引进胶原酶,藉胶原酶消化肝细胞间组织而达到分散肝细胞的目的。然后再经

分离纯化而得到所需用的肝细胞或非实质细胞,进行原代培养。65抗肝损伤和肝纤维化药实验法【操作步骤】(1)肝细胞的分散:先用无钙灌流液作预灌流,冲去残血,除去或减少肝细胞间的钙离子,以减少细胞间的粘着力。然后再用含钙的胶原酶灌流液灌流,以消化细胞间质而分散肝细胞。66抗肝损伤和肝纤维化药

实验法•1)动物手术:•大鼠麻醉,背位固定。剥去腹部皮肤,75%酒精消毒腹膜,无菌剪开,内脏移至左侧,暴露肝门静脉和下腔静脉。离肝入口1-1.5cm处将肝门静脉以及下腔静脉与周围组织分离开,各穿一根手术棉线,打一活套备用。•并经下腔静脉注射0

.06%肝素钠生理盐水溶液0.5~0.6ml。将静脉插管沿已分离的肝门静脉插入,使针头前端达左右肝静脉分支交汇处,迅速结扎棉线,固定门静脉插管。立即开始灌流。67抗肝损伤和肝纤维化药实验法2)预灌流:经无菌过滤,37℃和混合气体(95%02,5%C02)饱和的无

钙灌流液灌流,剪断下腔静脉。灌流速度从慢至快,最后保持在40~50ml/min。打开胸腔,前腔静脉管处系一棉线,从右心房处插管至前腔静脉处,然后扎紧手术丝线,以防针管脱落。随之将后腔静脉处的棉线扎紧,迫使灌注液改由前腔静脉

插管处流出。先作在位灌流数分钟,然后边灌流边切断肝与周围组织的联系,将肝移置肝托盘内继续灌流。不要损伤肝包膜。灌流液约500ml。68抗肝损伤和肝纤维化药实验法•3)酶灌流:换用37℃的通人02的胶原酶灌流液。胶原酶的

浓度一般约为0.05%左右。pH7.5,含钙而不含镁,含有机缓冲剂(如HEPES)。灌流速度仍维持40~50ml/min。胶原酶价贵,可设计循环灌流装置以节省用酶量。如果灌流通畅,则肝颜色均匀。•由于肝细胞间质被消化,灌流液进入细胞间隙,因而可见到肝逐渐肿胀。可根

据经验,肉眼观察肝肿胀程度来选择最佳灌流时间。•一般酶灌流约需8~15min。•4)分散肝细胞:取下肝,将之移至盛有适当培养液(DMEM)的平皿中,撕去肝包膜后,轻轻振摇肝,肝细胞即可散落于培养液中而成肝细胞悬液。69抗肝损伤和肝纤维化药实验法•(2)肝细胞

的纯化1)肝细胞的纯化:在锥形瓶肝细胞悬液37℃振荡培养15min。细胞碎片、库普弗细胞等则为由损伤细胞排出的粘性物质粘结成小块,可过滤时除去;完整的肝实质细胞则从外形不规则渐变为圆形,因而更加分散,也更易于通过滤网。振荡培养结

束后立即将锥瓶置冰水中冷却,用双层尼龙网(200目)过滤。滤液4C。200r/min离心3-5min,弃-上清,同上离心三次,培养液重悬,得到绝大部分为肝细胞悬液。70抗肝损伤和肝纤维化药实验法(4)肝细胞的培养

:•作短时间培养的实验可将适当稀释的肝细胞于合适的小试管内作振荡培养。如需作较长时培养,则要选用大小合适的培养皿加入适量的肝细胞,于C02培养箱内(5%C02与95%空气)进行单层细胞培养。如采用经过处理的塑料培养皿,则约经1.5-2h培养细胞即可贴壁;如采

用未经处理的玻璃培养皿,则需经8h左右肝细胞方能完全贴壁。71抗肝损伤和肝纤维化药实验法•【注意事项】•(1)灌流过程中如果肝颜色不均匀或出现花斑,即表明灌流不畅。灌流不畅时不仅细胞问质消化不够,减少分散的细胞产量,而且分散所得细胞的活率和

功能也差。缺氧/压力增高都会使肝细胞损伤。•灌流不畅的可能原因有:①肝位置不佳致血管扭曲;②插管插入过深,或插管尖头的斜面过长,堵塞了门脉血管的分支;③灌流液中存在小颗粒物质或微小气泡而堵塞小血管;④麻醉过深或手术时间过长,或麻醉前动物过度紧张、应激反应等儿茶酚胺类分泌过多等因素使血管收缩。•(2

)灌流液必须含有足够的缓冲剂系统,以保证酶灌流过程中pH维持在最适范围。72抗肝损伤和肝纤维化药实验法第7节大鼠肝星状细胞及库普弗细胞原代培养实验方法【基本原理】大鼠肝星状细胞(HSC)及库普弗细胞(KC)分离方法

是在肝离体灌流技术中,利用链霉蛋白酶裂解肝细胞、胶原酶解除肝非实质细胞间的连接、DNA酶降解DNA,形成较为完全的单细胞悬液,根据HSC和KC密度的不同,采用密度梯度离心的方法分离出HSC和KC,进行原代培养。73抗肝损

伤和肝纤维化药实验法•【操作步骤】•(1)动物及手术:一般选用300~450g体重的大鼠。乙醚麻醉或ip戊巴比妥钠50mg/kg,背位固定。常规消毒,剪开腹部皮肤,无菌条件下剪开腹膜,将内脏翻移至鼠体左侧,暴露肝门静脉和下腔静脉。在离肝入口1~1.5cm处将肝门静

脉以及下腔静脉近肾静脉分支部位与周围组织分离开,各穿1根手术棉线,打一活套备用。将静脉插管沿已分离的肝门静脉插入,使针头前端达左右肝静脉分支交汇处,迅速结扎棉线,固定门静脉插管,立即开始灌流。74抗肝损伤和肝纤维化药实验法•(2)预灌流:用经无菌过滤、

37℃恒温和混合气体(95%O2、5%CO2)饱和的D-Hank液(5.6%NaHCO3,调至pH7.4)进行肝灌流,同时剪断下腔静脉以备灌流液顺畅流出。灌流装置如图40-1所示,灌流速度从慢至快,最后保持在40~50mL/min。边灌流边将肝脏游离。注意不要

损伤肝包膜,并尽量保持肝叶和血管的正常位置,不可扭曲。预灌流一般需用灌流液约500ml。•(3)酶灌流:将肝移置漏斗内开始循环灌注酶消化液(含Ⅳ型胶原酶0.05%、蛋白酶E0.1%、HEPASE10mmol/L),流速15ml/min。约30

min可见肝组织变软,与肝包膜游离。一般每次用40~50ml酶灌流液即可满足要求。如果灌流通畅,则肝颜色均匀。75抗肝损伤和肝纤维化药实验法•(4)分散细胞:取肝脏置培养皿中,加20ml肝组织消化液(含Ⅳ型胶原酶0.02%、蛋

白酶E0.01%、DNA酶0.001%)。轻轻撕开包膜,37℃水浴振荡消化30min,剔除肝包膜和结缔组织。细胞分散,200目滤网过滤,离心(150×g,10min,4℃)。以Hank液重新悬浮细胞,与18%Nyco

denz以1:2比例充分混匀,上覆约1mlHank液,进行密度梯度离心(450×g,20min,4℃)此时,由于HSC与库普弗细胞密度不同而处在不同位置,HSC处在界面,KC处在界面下。76抗肝损伤和肝纤维化药实验法(5)HSC的分离、培养:用尖头吸管小心吸取界面

细胞,离心(150×g,10min,4℃),洗去Nycodenz。将细胞沉淀重悬于DMEM培养液中,以2×108/L细胞浓度接种于培养瓶中。5%CO2、37℃恒温培养48h,换液除去未贴壁细胞,由此纯化HSC,

以后每隔3~4d换液1次。10d后用0.125%Trypsin消化并传代。(6)KC的分离、培养:用尖头吸管小心吸取界面下细胞,离心(150×g,10min,4℃)。RPMI1640培养液中,以2×108/L细胞浓度接种于24孔培养板中,每孔1ml。5%CO2、37

℃的CO2孵箱中培育贴壁6h,吸弃培养液,用37℃预温的Hank液洗涤3次,除去未贴壁细胞。重新加入RPMI1640培养液,继续培养。首次24h更换新鲜的RPMI1640培养液,以后每3~4d换液1次。7

7抗肝损伤和肝纤维化药实验法•【注意事项】(1)体重较大的大鼠,其HSC密度低,利于与其他非实质细胞分离。(2)门静脉插管太深,以免伤及肝脏引起灌流不良,出现花斑。(3)预灌流要迅速彻底,冲净肝脏血液,否则会影响下一步酶消化效果,避免气泡进入门静脉引起血管空气栓塞,导致灌注不

充分。(4)结扎要迅速,以免凝血。(5)一般以肝脏明显变软、胞膜内容物成胶冻状为佳,既保证充分消化,又要防止消化过火,影响细胞活力。(6)取出肝脏,不要伤及肝脏及胃肠道,以免造成污染。(7)保证进入肝脏的灌流液实际温度在37℃。(8)整个操

作过程要严格无菌,以保持细胞的活力。78抗肝损伤和肝纤维化药实验法

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