【文档说明】教培用讲解分子技术在肿瘤靶向药物治疗的应用课件.ppt，共(62)页，1.871 MB，由小橙橙上传

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讲解分子技术在肿瘤靶向药物治疗的应用荧光原位杂交（Fluorescenceinsituhybridization，FISH）技术简介•FISH=FluorescenceInSituHybridization•利用荧光标记的DNA探针检测组织或细胞内与其互补的DNA片段•应

用：遗传病诊断血液肿瘤实体瘤•样本：羊水、绒毛、流产组织、外周血、骨髓、体液及各种肿瘤组织等用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上

是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位荧光标记探针探针变性样本DNA变性杂交工作原理FISH检测染色体易位（Translocation）在淋巴瘤分型中的应用FISH技术在淋

巴造血系统肿瘤中的应用检测技术特点•不同类型的淋巴瘤染色体易位类型不同•优点适用于形态学上难以诊断且IHC结果不理想的标本；适用于细胞数量少，形态不典型的活检及穿刺组织。•必须结合组织形态学和免疫组化结果作最后诊断！！！FISH基因检测在淋巴瘤的应用弥漫大B细胞淋巴瘤（DL

BCL）按免疫组化亚型分为CD5阳性DLBCL生发中心B细胞样变型(GCB)、非生发中心B细胞样变型(non-GCB)3类可根据CD10、BCL6、MUM1的表达区分生发中心B细胞样变型、非生发中心B细胞样变型。>30%瘤细胞表达CD10或CD10(-)、BCL-6(+

)、MUM-1(-)诊断为GCB;其他病例则为non-GCB。◆BCL6基因断裂---辅助诊断弥漫性大B细胞淋巴瘤◆BCL6基因断裂重排----判断预后目前研究确定至少40%的DLBCL涉及BCL6基因重排。一项针

对102名DLBCL患者的BCL6重排情况及其与预后关系的研究显示，BCL6阳性患者诊断治疗36个月后，疾病停止发展的比率为82%，携带有BCL6重排的病例预后较好。BCL6基因断裂与弥漫性大B细胞淋巴瘤Offit,K.NEnglJMed,1994.331(2

):p.74-80.结果判读IGH/CCND1融合基因可见于95%的套细胞淋巴瘤，是套细胞淋巴瘤与其他淋巴瘤鉴别的重要指标。◆IGH/CCND1融合基因--辅助诊断套细胞淋巴瘤。IGH/CCND1融合基因与套细胞

淋巴瘤l正常细胞：两个红色信号，两个绿色信号。l异常细胞：一个红色信号，一个绿色信号，两个融合信号。API2/MALT1基因检测试剂盒探针：GLPAPI2/GLPMALT1凋亡抑制因子2基因（apoptosisinhibitor-2,API2）,位于11号染色体;粘膜相关淋巴组织基因

（Mucosa-associatedlymphoidtissue1,MALT1），位于18号染色体。API2基因与MALT1基因的融合导致凋亡抑制的增加，引起细胞不依赖于抗原刺激的生存优势。◆API2/MALT1融合基因的检测可以指导抗HP治疗胃MALT淋巴瘤与

幽门螺旋杆菌（HP）感染导致的慢性胃炎有关，MALT1/API2融合基因阴性的患者抗HP治疗有效，阳性患者抗HP治疗无效。API2/MALT1融合基因检测意义l正常细胞：两个红色信号，两个绿色信号。l异常细胞：一个红色信号，一个绿色信号，两个融合信号。BCL2/

IGH重排发生在约80%-85%的FL患者中，检测BCL2/IGH基因重排可以辅助诊断FL。BCL2/IGH阴性的FL患者3年生存率为100%，而阳性者只有54%；阴性者3年疾病无进展为87.5%，而阳性者只有13%。BCL2/IGH融合基因与滤泡性淋巴瘤◼BCL2/IGH融合基因-

----辅助诊断滤泡性淋巴瘤◼BCL2/IGH融合基因-----判断预后l正常细胞：两个红色信号，两个绿色信号。l异常细胞：一个红色信号，一个绿色信号，两个融合信号。结果判读-阳性结果结果判读-阳性结果约80%的伯基特淋巴瘤

病例发生t(8；14)（q24;q32）；约15%的伯基特淋巴瘤病例发生t(2；8)(p11;q24)；约5%发生t(8；22)（q24;q11）。染色体易位导致C-MYC基因断裂重组可能是伯基特淋巴瘤的一个标志，可以应用于临床上伯基特淋巴瘤的辅助诊断。C-MYC基因断裂与

伯基特淋巴瘤◆辅助诊断伯基特淋巴瘤结果判读-阳性结果FISH技术在乳腺癌靶向治疗应用存在EGFR基因扩增的肺癌、肠癌病人对分子靶点药物更为敏感。l异常细胞：一个红色信号，一个绿色信号，两个融合信号。致癌基因：Her-2基因；2+,1+,-按免疫组化亚型分为FISH检测是否有基因

扩增EGFR作为预后因子的价值FISH技术在乳腺癌靶向治疗应用寡核苷酸连接检测(OligonucleotideLigationAssay,OLA)讲解分子技术在肿瘤靶向药物治疗的应用200４年获得FDA审批资格治疗结

直肠癌FISH：呈簇团状高度扩增EGFR作为预后因子的价值完全人源化单克隆抗体(IgG2)Real-TimePCR乳腺癌Her-2基因l致癌基因：Her-2基因；l位点：17q11.2-q12；l编码蛋白：跨膜蛋白（与表皮生长因子受体部分同源）；l25-30%

乳腺癌病人都有HER-2的扩增；lHER-2基因扩增是决定Herceptin治疗是否有效的关键性指标。lHER2扩增的乳腺癌更具有侵袭性生长能力。乳腺癌Her-2基因及蛋白检测Cerb-B-2:3+完全强膜阳性细

胞>30%2+,1+,-FISH检测是否有基因扩增Her2基因检测流程石蜡组织标本IHC检测再用FISH方法检测—1+3+2+—+Herceptin治疗+再用FISH方法检测Herceptin治疗FISH检测+—再用FI

SH方法检测+A.无须计数的大簇团信号（高度扩增）B.颗粒状信号（R>10，高度扩增）C.须计数的颗粒状信号（R=3.5，低度扩增）ACBHer-2基因扩增状况>30%的肿瘤细胞全部的细胞膜高强度着色免疫组化（3+）与FISH对比×40×100浸润性导管癌Ⅱ级IHC：++

+FISH：呈簇团状高度扩增×100免疫组化（－）与FISH扩增阳性浸润性导管癌Ⅱ级IHC：－FISH：呈簇状扩增肿瘤细胞不着色×40×100基因突变检测方法酶A切割(RnaseAcleavage)2.变性梯度

凝胶电泳(DGGE)3.杂合双链分析法(HA)4.化学切割错配(CCM)5.碳化二亚胺检测(Carbodiimide,CDI)6.酶促切割错配(EnzymeMismatchCleavage,EMC)7.单链构象多态性(Sing

le-StrandConformation)8.切割片段长度多态性测序(Sequencing)10.双脱氧指纹图谱法(DideoxyFinger-printing,ddF)11.错配接合蛋白检测12.蛋白截短测试（

proteintruncationtest）方法13.变性的高效液相色谱检测(DenaturingHighPerformanceLiguldChromatographyDHPLC)14.DNA芯片技术(DNAchip)16.等位基因特异性寡核苷酸片段分析(Allele-Spec

ificOligonucleotide,ASO)17.引物延伸检测(PrimerExtension,PEX)18.寡核苷酸连接检测(OligonucleotideLigationAssay,OLA)19.限制性片段分析(RestrictionFragmentAn

alysis）20.突变体富集PCR法（mutant-enrichedPCR）21.蝎形探针扩增阻滞突变系统（Scorpionsamplificationrefractorymutationsystem）肺癌组织E

GFR基因扩增和突变检测及其临床意义研究背景研究显示吉非替尼对部分晚期NSCLC患者的治疗效果非常显著。存在EGFR基因突变的患者更有可能对吉非替尼的治疗敏感。存在EGFR基因扩增的肺癌、肠癌病人对分子靶点药物更为敏感。检测大肠癌有无EGFR过度表达，只要>1%的癌细胞的胞膜强阳性染色即判

断为3+，可作为应用西妥昔单抗的指征。•FISH检测EGFR基因扩增标本类型：石蜡包埋组织（手术、活检、穿刺）冰冻组织胸、腹水沉渣细胞探针类型：GLPEGFR/CSP7•定量PCR检测EGFR基因突变分型l突变类型：19ex

on（2235-2249位点）15bp缺失突变19exon（2240-2257位点）18bp缺失突变19exon（2240-2251位点）12bp缺失突变21exon2573位点T>G碱基置换突变21exon2582位点T>G碱基置换突变EGFR基因变异检测双体性三体性多体性扩增EGFR基因FIS

H检测状况肺癌石蜡FQ-PCR分型技术检测EGFR突变存在EGFR突变肺癌样本的琼脂糖凝胶电泳图71例肺癌组织中检测出6例突变样本FQ-PCR检测15bp缺失阳性病例结果红色阈值线以上的扩增曲线即为阳性标本的扩增曲线，按荧光信号值的高低依次为9号、12号、13号、55号、38号和33号标

本15bp缺失突变型DNA的测序图senseantisense红色阈值线以上的扩增曲线即为阳性标本的扩增曲线，按荧光信号值的高低依次为2号、36号、和40号标本FQ-PCR检测18bp缺失阳性病例结果目前K-RAS突变检测常用技术方法•直接测序•焦磷酸测序•高分辨率熔解曲线•PCR-RFL

P•芯片•杂交•Real-TimePCR肿瘤组织的确认和筛选显微切割肿瘤提取DNA相应的PCR反应或杂交相关的分析和检测K-ras突变检测基本流程图直接测序(DirectSequencing)PCR扩增后产物直接测序•双脱氧核苷酸链终止法(Sanger法)DNA片段是

荧光标记的，这些片段经过平板胶电泳或毛细管电泳得到分离，荧光分子被激发而发光，发出的光信号被检测系统检测K-ras突变检测结果疗效预测标志物与预后判断标志物•疗效预测标志物：能够预测某种特定治疗方式疗效的标记

物–KRAS基因突变导致肿瘤对EGFR抑制剂抵抗•预后判断标志物：在不考虑治疗因素的情况下能够判断患者结局的标记物–18号染色体长臂（18q）缺失•某些分子标志物兼具两种作用–胸腺嘧啶合成酶（Thymidylatesynthase）EGFR作为预后因子的价值EGFRexpr

essioncorrelateswithpoorprognosisDFS=Disease-freesurvival;OS=overallsurvival•Cetuxamab(西妥昔单抗)–人源化嵌合单抗（IgG1）–靶向作用于表皮生长因子受体（EGFR）•阻断EG

F和TGFα与EGFR的结合，抑制酪氨酸激酶活性和其后的肿瘤生长–200４年获得FDA审批资格治疗结直肠癌•Panitumumab（帕尼单抗）–完全人源化单克隆抗体(IgG2)–靶向作用于表皮生长因子受体（E

GFR）–2005年7月获得FDA快速通道审批资格治疗结直肠癌结直肠癌分子靶向治疗药物KRAS突变•KRAS突变可不依赖EGFR受体途径，自行激活RAS/MAPK通路–导致ERBITUX耐药–KRAS突变与Erbitux疗效及患者生存相关•KRAS突

变并非孤立事件–KRAS突变常伴随BRAF突变，并与CpG岛甲基化表型(CIMP)1,2相关–KRAS突变常伴随PI3K突变3LièvreA,etal.JClinOncol;26:374–379MAPK=mitogen-activatedproteinkin

aselK-ras基因野生型患者能从这类药物治疗中获益。lK-ras基因突变型患者并不能从抗EGFR治疗中获益,反而徒增不良反应危险和治疗费用；抗EGFR治疗和K-ras突变相互排斥K-ras基因抗EGFR治疗关系密切•年7月FDA批准了对西妥昔单抗和帕尼单抗说明书标签的修改

：•结直肠癌分子靶向治疗药物注明KRAS基因突变的结直肠癌患者不推荐这使用这两种用药物。lK-ras基因突变:20-60%结直肠癌lK-ras基因突变发生在肿瘤恶变的早期，原发灶和转移灶的K-ras基因高度保持一致K-ras基因突变➢NCCN临床实践指南指南明确指

出所有转移性结直肠癌患者➢都应检测K-ras基因状态。➢临床肿瘤学会(ASCO)推荐把K-ras基因突变检测作为➢结直肠癌患者接受EGFR单抗治疗的预测指标。➢欧盟药品审评管理局规定：cetuximab及panitumumab➢用于mCRC的治疗前，患者必须确定为K-ras野

生型。K-ras与结直肠癌治疗等位基因特异性寡核苷酸片段分析(Allele-SpecificOligonucleotide,ASO)限制性片段分析(RestrictionFragmentAnalysis）导致ERBITUX耐药—

butforpatientswithwild-typeKRAStumors结直肠癌分子靶向治疗药物FISH检测是否有基因扩增NEnglJMed,1994.JClinOncol2007;25:3230–3237

FQ-PCR检测18bp缺失阳性病例结果乳腺癌Her-2基因BCL2/IGH阴性的FL患者3年生存率为100%，而阳性者只有54%；生发中心B细胞样变型(GCB)、约15%的伯基特淋巴瘤病例发生t(2；19exon（2240-2

251位点）12bp缺失突变致癌基因：Her-2基因；研究显示吉非替尼对部分晚期NSCLC患者的治疗效果非常显著。KRAS基因突变导致肿瘤对EGFR抑制剂抵抗KRAS基因突变导致肿瘤对EGFR抑制剂抵抗EGFR作为预后因子的价值结直肠癌（C

RC）缺乏EGFR基因突变•对爱必妥单药治疗转移性结直肠癌（mCRC）临床试验中110例活检标本进行的研究未发现EGFR基因突变（外显子18－21）Khambata-FordS,etal.JClinOncol2007;25:3230–3237抗EGFR治疗前检测KRAS基因突变

的理由1.避免不必要的不良反应2.控制不必要的费用3.确认能够从治疗中获益的野生型患者4.避免治疗对突变型患者的潜在毒性CHMPgaveapositiveopinionforERBITUXMay29,—butforpatients

withwild-typeKRAStumors•810名胃癌病人有HER2基因的扩增，约占参与实验总人数的22%；•晚期胃癌接受标准化疗联合Herceptin治疗的患者：平均生存期由个月延长到个月；高倍扩增者甚至可达16个月；将死亡风险降

低26%。HER2与胃癌分子靶向治疗临床肿瘤学会ASCO提出：◆Herceptin可成为HER2阳性晚期胃癌患者的治疗选择。◆晚期胃癌患者在确诊时都应接受HER2检测；HER基因与胃癌预后HER2基因扩增的晚期胃癌患者往往预后不佳。•无HER2基因扩

增的晚期胃癌患者中位生存期个月，而有基因扩增者中位生存期仅个月。•存在HER2基因扩增的胃癌患者术后5年生存率为21.4%，而无扩增的则为63.0%。