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八、目的基因在受体细胞中的表达❖基因表达：结构基因在生物体内的转录、翻译以及所有加工过程。❖基因工程中基因的高效表达：外源基因在生物体内的转录、翻译以及所有加工过程真核基因在原核细胞中表达的困难1.细菌RNA聚合酶不能识别

真核基因的启动子2.mRNA的SD序列不能与核糖体结合3.真核蛋白易被细菌蛋白酶破坏几种常见的表达系统❖原核表达系统❖真核表达系统大肠杆菌枯草杆菌酵母哺乳动物细胞昆虫细胞植物细胞（一）原核细胞表达体系❖大肠杆菌：最常用的表达形式。❖大肠杆菌表达外源基

因的优势全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架基因克隆表达系统成熟完善繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物❖大肠杆菌表达外源基因的劣势大肠杆菌不存在信号肽，产物为胞内产物，提取时需裂解细胞，导致产物含大量杂质；蛋白产物常为包涵体，需

经过复性才能恢复蛋白活性；缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统，不适用于需糖基化修饰的蛋白质；内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白；翻译常从AUG开始，目的蛋白的N端常多一个甲硫氨酸残基，会引起免疫反应；细胞周质内含有种类繁多的

内毒素。1、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素A.外源基因的剂量B.外源基因的表达效率①启动子的强弱：容易被RNA聚合酶识别并能够稳定结合；②核糖体结合位点的有效性；消除相关二级结构。③SD序列和起始密码的间距；④密码子组成；选择大肠杆菌偏爱的密码子。C.表达产

物的稳定性①组建融合基因；②利用内源或外源信号肽将产物运送到胞间浆周质；③改变真核蛋白质二级结构；④采用蛋白酶缺陷型大肠杆菌。Ion-营养缺陷型大肠杆菌不能合成黄嘌呤核苷，从而不能合成蛋白酶。D细胞的代谢负荷外源基因的表达产物可能本身对宿主菌有毒性，或因消耗其氨基酸等营养物质对宿主

菌产生间接毒害。解决方案：❖将细胞的生长和外源基因的表达分为两个阶段；❖将细胞的生长与质粒的表达分开；❖蛋白质以包涵体形式存在。E工程菌的培养条件pCP3拥有一个温度可诱导型的复制子，在28℃时，每个

细胞的质粒拷贝数为60在42℃时，拷贝数迅速增至300–600。2真核基因在大肠杆菌中的表达形式①以融合蛋白的形式表达药物基因蛋白质在菌体内比较稳定；融合蛋白本身不能做注射用药；可以通过特殊设计，

将两类蛋白分开。❖凝血因子Xa专一识别Ile-Glu-Gly-Arg;❖CNBr专一性切割甲硫氨酸。NHCOOH原核序列真核序列❖②以非融合蛋白的形式表达药物基因外源基因的表达产物不含细菌多肽序列。❖易被细菌蛋白酶降解；

❖常含有甲硫氨酸，用药时易引起免疫反应。外源基因的结构细菌启动子SD序列AUG结构基因终止密码❖③以分泌型表达蛋白药物的基因外源基因的表达产物在胞质内合成，后被运输至细胞周质，信号肽被信号肽酶识别、切割。

❖避免被细菌蛋白酶降解；❖产物不含有甲硫氨酸；❖产量不高；❖信号肽不切割或切割位置不正确。外源基因的结构细菌启动子SD序列AUG结构基因终止密码信号肽3枯草芽孢杆菌❖优势：分泌能力强，将蛋白质产物分泌到细胞液中，故不

产生包涵体；❖局限性：具有极强的胞外蛋白酶，对产物进行不同程度的降解；能进行产物的糖基化。4链霉菌❖优势：非致病，使用安全；分泌能力强，不形成包涵体；具有糖基化能力；已构建了一系列的表达载体；下游培

养工艺成熟。——新的外源基因表达体系（二）真核细胞表达体系❖酵母：最有效的单细胞真核微生物。常用啤酒酵母。❖动物（哺乳动物和昆虫）❖植物细胞❖酵母表达外源基因的特点：全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，

遗传操作简便；大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉；成功建立了几种有分泌能力的表达系统；表达产物可以进行糖基化；具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统；不含有特异性的病毒、不产内毒素；酵母菌是最简单的真核模式生物。酵母菌的结构酵母菌中的野生型质粒酿酒酵母中的2m环状质粒

几乎所有的酿酒酵母中都含有2m双链同源重组REP1RAFSTBoriREP2FLPIRIRAB环状质粒，拷贝数达50至100个。IRs反向重复序列，600bp，重组FLP编码产物驱动IRs的同源重组REP编码产物控制质粒的稳定性STBREP的结合位点接合酵母属

中的pSR1和pSB1，以及克鲁维酵母属中的pKD1等均与2m质粒类似。1载体的分类：根据载体的复制序列分为四类：❖（1）YEp类：复制序列为酵母天然的2m-双链环状质粒成分。拷贝数可高达100-200。❖（2）YRp类：非2m-来源的自主复制序列（ARS）。拷贝数5-10。❖（3）YCp类：非2

m-来源的自主复制序列（ARS）。含酵母染色体中心粒成分，拷贝数1。（4）YIp类：含有可与酵母染色体重组的序列，整合到酵母染色体中，随酵母染色体一起复制，稳定性好。拷贝数1。❖质粒转化酵母通常有两种方式：碱金属离子（Li)介导的酵母菌完整细胞的转化酵母菌电击转化法❖鉴于从大

肠杆菌转化和制备质粒比酵母容易的多，可向酵母载体中引入大肠杆菌的起始和抗生素筛选标记，此类克隆载体即可以在细菌中，又可以在酵母中进行质粒复制和表型选择。2克隆载体3表达载体❖啤酒酵母表达系统❖乳酸克鲁维酵母表达系统❖巴斯德毕赤酵母表达系统影响目的基因在酵母菌中表

达的因素❖1外源基因的剂量：高拷贝数质粒常会引起细胞生长量降低。❖2外源基因的表达效率：（1）启动子：❖组成型启动子：在各个生长时期表达❖诱导型启动子：受诱导物或诱导条件的影响酿酒酵母PHO5启动子在培养基中游离磷酸盐耗尽时才

能打开;PHO4基因编码产物是PHO5启动子的正调控因子，PHO4温度敏感型突变基因pho4TS的编码产物在35℃时失活，因此，装在pho4TS-PHO5启动子下游的外源基因在35℃时关闭，23℃诱导表达.（2）分泌信号的效率：（3）终

止序列的影响：❖终止序列保证了转录产物（mRNA）在适当部位终止，并加上polyA尾巴。❖常用的终止子有：ADH1,CYC1,MF∝1，PGK。信号肽+前导肽表达产物的运输表达产物的修饰3外源蛋白的糖基化❖外源蛋白在酵母细胞中存在两种

糖基化形式：N-糖苷键（天冬酰胺连接）和O-糖苷键（丝氨酸或苏氨酸连接），与天然状态下相同。❖酵母细胞能够识别这两种糖基化信号，使外源蛋白正确折叠，产生与天然状态相同的蛋白，分泌到胞外。第三节基因工程菌的不稳定性❖一、质粒的不稳定性1质粒的不稳定分为分裂不稳定和结构不稳定2质粒的不稳

定性产生的原因❖（1）工程菌的质粒由于分裂的原因而不稳定；工程菌分裂时会产生不含质粒的子代菌，造成质粒的丢失；两种菌的比生长速率有差异。❖（2）工程菌质粒结构的不稳定是由于DNA从质粒上丢失、重排、缺失导致工程均

性能的改变。二、提高质粒稳定性的方法❖1选择合适的宿主菌；❖2选择合适的载体；❖3添加选择压力；对结构不稳定质粒和大规模生产无效。药物和食品生产时禁止使用抗生素❖4分阶段控制培养；为提高培养过程中质粒的稳定性，一般采用两阶段法，第一阶段先使菌体生长至一定密度，第二阶

段诱导外源基因的表达。在培养基中加入选择性压力如抗生素等，以抑制质粒丢失菌的生长，也是提高质粒稳定性的方法。❖5控制培养条件；采用适当的操作方式可使工程菌生长速率具有优势，并使工程菌和质粒丢失菌生长竞争趋于极端化。可调控的环境参数为温度、pH、培养基组分和溶解氧浓度。通过间隙供氧和改变稀释速率

都可以提高质粒的稳定性。❖6固定化：固定化载体有海藻酸胶、卡拉胶、明胶、甲壳素等。固定化培养大肠杆菌W3110（pTG201）240代没有测到质粒丢失。二、提高质粒稳定性的方法培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定培养温度：较低的培养温度有利于重组质粒的稳定固定化方

法酶的固定化方法有下述4种：吸附法，包埋法，共价键结合法，交联法EEEEEEEEEEEEEEEEEEE吸附法共价结合法交联法包埋法固定化菌体概念：把菌体细胞中特定的酶不经过分离提纯直接用适当的方法将菌体加以固定来催化各种特定的生物化学反应。优点：不需提制酶，

可保持酶的活性。反复使用，成本低——与固定化酶比较制备方法：与固定化酶相同，有包埋法、载体结合法、交联法、热处理法、射线处理法。其中包埋法是最理想的方法。一包埋法1原理在菌体细胞本身不发生化学反应的情况下，将其包进半透性的多聚

物膜内。小分子的底物和产物均可自由出入，而菌体细胞却不会漏出。2方法常用的包埋材料是：聚丙烯酰胺凝胶、明胶、琼脂以制备含天门冬氨酸的大肠杆菌细胞为例将菌体细胞预先用生理盐水悬浮，向悬浮液中加入聚丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺，然后加入催化剂过硫酸胺和加速剂四

甲基乙二胺，混匀后放置一定时间聚合。将得到的凝胶破碎即得到固定化细胞。收率达72.5％包埋法制备固定化菌体应用举例包埋材料菌种酶系用途琼脂大肠杆菌大肠杆菌谷氨酸脱羧酶青霉素酰胺酶制造γ-酪蛋白生产6-氨基青霉烷酸(6-APA)明

胶－戊二醛短乳杆菌链霉菌葡萄糖异构酶从葡萄糖生产高果糖浆聚丙烯酰胺大肠杆菌天门冬氨酸酶醋酸纤维素大肠杆菌青霉素酰胺酶（裂解）青霉素酰胺酶（合成）生产6－APA生产半合成青霉素二载体结合法（吸附法）1原理微生

物细胞表面带有电荷，在适当的条件下可以与载体的离子交换基团形成络合物或吸附在载体上。2常用载体离子交换纤维素。阴离子树脂、DEAE－纤维素。3优缺点优点：方法简单、载体易于再生。缺点：结合力弱，菌体细胞易脱落。载体结合法制备固定化菌体举例载体菌

体酶用途离子交换纤维素丝状菌孢子转化酶蔗糖的转化阴离子树脂放线菌葡萄糖异构酶制造果糖DEAE-纤维素巨大芽孢杆菌青霉素酰胺酶制造6APA基因工程制药上游技术基因分离基因连接基因转化筛选基因表达从基因组中直接分离cDNA文库PCR法化学合成平末端的连接

粘末端的连接抗生素筛选蓝白斑筛选序列筛选真核、原核表达系统生理代谢菌种筛选种子培养发酵培养基因工程菌的培养设备❖发酵罐第四节基因工程药物的分离纯化生物技术产品一般是活性肽或蛋白质，它们具有如下特点：①初始物料中含量低；②基体组成复杂；③稳定性差

；④种类多，包括大、中、小分子、结构简单或复杂的有机化合物，以及结构复杂而又性质各异的生物活性物质；⑤应用面广，要求质量、纯度高，无菌无热源等。一、建立分离纯化工艺的根据❖1、含目的产物的起始物料的特点❖2、物料

中杂质的种类和性质❖3、目的产物特性❖4、产品质量要求二、分离纯化的基本过程❖一般包括如下几个方面的过程：细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工。基因工程药物分离纯化的一般流程发酵液细胞分离胞内产物胞外产物细胞破碎固液分离包含体细胞碎片分

离变性复性浓缩初步分离高度纯化制剂产品❖分离纯化要求：条件温和、选择性好收率高、两个技术之间能直接衔接以及整个过程要快，能满足高生产率的要求。❖1、细胞破碎与固液分离：❖收集—破碎—固液分离：离心、萃取、膜技术等❖2、目的产物的分离纯化：色谱方法❖3

、非蛋白质类杂质的去除：主要是DNA、热原质和病毒。三细胞的破碎方法❖外力使用与否：机械法，非机械法❖属性：物理法、化学法、生物法渗透冲击物理法化学法生物法匀浆法珠磨法超声法增溶法酶溶法方法技术原理效果成

本举例化学法渗透冲击渗透压破坏细胞温和便宜血红细胞的破坏酶消化法细胞壁被消化，使细胞破碎温和昂贵增溶法表面活性剂溶解细胞壁温和适中胆盐作用于大肠杆菌脂溶法有机溶剂溶解细胞壁并使之失稳适中便宜甲苯破碎酵母细胞碱处理法碱的皂化作用使细胞壁融解

剧烈便宜细胞化学破碎法方法技术原理效果成本举例机械法匀浆法（片型）细胞被搅拌器劈碎适中适中动物组织及动物细胞研磨法细胞被研磨物磨碎适中便宜超声波法用超声波的空穴作用使细胞破碎适中昂贵细胞悬浮液小规模处理匀浆法（孔型）须使细胞通过的小孔，使

细胞受到剪切力而破碎剧烈适中细胞悬浮液大规模处理珠磨破碎法细胞被玻璃珠或铁珠捣碎剧烈便宜细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理细胞物理破碎法JJ-2组织捣碎匀浆机2.Ultrasonication超声波超声波破碎仪WSK卧式高效全能珠磨机3.Crushinginballmill

珠磨法ZM系列卧式密闭珠(砂)磨机生物破碎法四固液分离❖离心沉淀❖萃取：聚乙二醇－无机盐双水相萃取❖膜过滤微滤：分离细胞、细胞碎片、包涵体、蛋白质沉淀物。超滤：浓缩蛋白质、多糖、核酸等大分子物质。反渗透：脱去抗生素、氨基酸等小分子中的水分。根据分子大小不同的纯化方法（透析和超滤）透析超滤

❖双水相现象是当两种聚合物或一种聚合物与一种盐溶于同一溶剂时，由于聚合物之间或聚合物与盐之间的不相容性，当聚合物或无机盐浓度达到一定值时，就会分成不互溶的两相。❖因使用的溶剂是水，因此称为双水相，在这两相中水分都占很大比例(85％一95％)，活性蛋

白或细胞在这种环境中不会失活，但可以不同比例分配于两相，这就克服了有机溶剂萃取中蛋白容易失活和强亲水性蛋白难溶于有机溶剂的缺点。双水相萃取(AqueousTwoPhaseExtraction)五重组蛋白质的分离纯化❖产物特性及在分离纯化中的作用❖基因工程药物在生产过程中常用的分离纯化方

法（一）离子交换层析❖离子交换层析（IonExchangeChromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一

种层析方法。❖1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。本世纪40年代，出现了具有稳定交换特性的聚苯乙烯离子交换树脂。50年代，离子交换层析进入生物化学领域，应用于氨基酸的分析。目前离子交换层析仍是生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如

氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。平衡离子能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用

，称为阴离子交换剂。1离子交换层析的基本原理固定相（离子交换剂）载体（惰性高分子聚合物基质,形成骨架结构）（共价结合于载体上的荷电基团,功能基团）（以离子键与活性基团连接，平衡离子）活性基团活性离子在稀溶液中，离子交换剂与各种水合离子(离子

在水溶液中发生水化作用形成的)的结合力与离子的电荷量成正比，而与水合离子半径的平方成反比。所以，离子价数越高，结合力越大。在离子间电荷相同时，则离子的原子序数越高，水合离子半径越小，结合力亦越大。离子交换

的原则因此在稀溶液中离子发生水化时，各种阴离子和阳离子结合力大小的排列序次如下：一价阳离子：Li+<Na+<K+<Rb+<Cs+(对阳离子交换剂)一价阴离子：F—<Cl—<Br—<I—(对阴离子交换剂)不同价阳离子：Na+<Ca2+<A13+<Ti4+

(对阳离子交换剂)++++++++++++++++++++++++++++++◆-▲+◆-◆-◆-◆-▲+▲+▲+▲+▲+▲+▲+▲+◆-◆-◆-◆-◆-◆-◆-◆-◆-◆-◆-平衡缓冲溶液洗脱缓冲溶液1离子交换层析的基本原理2离子交换层析的基本操作正吸附：目的产物离子化负

吸附：杂质离子化❖（1）离子交换剂的选择：★强酸或强碱型离子交换剂适用的pH范围广，常用于分离一些小分子物质或在极端pH下的分离。由于弱酸型或弱碱型离子交换剂不易使蛋白质失活，故一般分离蛋白质等大分子物质常用弱

酸型或弱碱型离子交换剂。★离子交换剂基质：聚苯乙烯等疏水性离子交换剂常用于分离小分子物质，如无机离子、氨基酸、核苷酸等。纤维素、葡聚糖、琼脂糖等亲水性离子交换剂，适合于分离蛋白质等大分子物质。★离子交换剂颗粒：一般来说颗粒小，分辨率高，但平衡离子的平衡时

间长，流速慢；颗粒大则相反。所以大颗粒的离子交换剂适合于对分辨率要求不高的大规模制备性分离，而小颗粒的离子交换剂适于需要高分辨率的分析或分离。（2）离子交换剂的预处理、再生和保存：预处理：新启用的离子交换剂膨化水浮选酸处理清洗至中性

碱处理清洗加电荷再生：处理使用过的离子交换剂，使其恢复原有性状。水冲洗酸处理清洗至中性碱处理清洗加电荷保存：洗去杂质，加防腐剂，4℃保存。❖离子交换层析要根据分离的样品量选择合适的层析柱。离子交换用的层析柱一般粗而短，不宜过长。直径和柱长比一般为1:10到1

:50之间；层析柱安装要垂直；装柱时要均匀平整，不能有气泡。（3）层析柱：（4）平衡缓冲液❖平衡缓冲液是指装柱后及上样后用于平衡离子交换柱的缓冲液。平衡缓冲液的离子强度和pH的选择首先要保证各个待

分离物质如蛋白质的稳定；使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合，并尽量使待分离样品和杂质与离子交换剂的结合有较大的差别。一般是使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结合。而尽量使杂质不与离子交换剂结合或结合不稳定。在一些情况下（如污水处理）可以使杂质与离子交换剂有牢固的结合，而样品与离子交

换剂结合不稳定，也可以达到分离的目的。另外注意平衡缓冲液中不能有与离子交换剂结合力强的离子，否则会大大降低交换容量，影响分离效果。（5）上样❖离子交换层析的上样时应注意样品液的离子强度和pH值，上样量也不宜过大，一般为柱床体积的1－5％为宜，以使样品能吸附在层析柱的上层

，得到较好的分离效果。（6）洗脱❖梯度洗脱：改变离子强度或pH值❖阶段洗脱：用不同的洗脱缓冲液❖洗脱速度洗脱液的流速也会影响离子交换层析分离效果，洗脱速度通常要保持恒定。一般来说洗脱速度慢比快的分辨率要好。（7）浓

缩、脱盐离子交换层析得到的样品往往盐浓度较高，而且体积较大，样品浓度较低。所以一般离子交换层析得到的样品要进行浓缩、脱盐处理。（二）疏水层析❖利用蛋白质分子表面上的疏水区域和固定相中的疏水基团之间的相互作用力的差异，对蛋白质组分进行分离的层析方法。❖优势：蛋白质不易变性，活性不易流失。疏水层析的基

本原理❖在高盐浓度时，蛋白质分子中疏水性部分与介子的疏水基团产生疏水性作用而被吸附；盐浓度降低时蛋白质疏水性作用减弱，目的蛋白质被逐步洗脱下来，蛋白质疏水性越强，洗脱时间越长。（三）亲和层析（affinitychro

matography，AC）❖亲和层析是利用固定化配体与目的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附，如抗体与抗原、受体与激素、酶与底物之间的作用。亲和层析原理亲和层析的基本原理载体配体■▲▲■■▲▲■▲▲▲▲▲■■■

▲▲（四）凝胶过滤层析（gelfiltrationchormatography)❖凝胶过滤层析又称为：凝胶排阻层析，分子筛层析。是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小对溶液中各组分进行分离的液相层析方法。六、非蛋白质类杂质的去除1DNA的去除：DNA在pH4.0以上呈阴离子—

—阴离子交换吸附；蛋白质为强酸性——阳离子交换吸附；疏水层析；高盐浓度下，蛋白质与固定相结合；亲和层析：特异吸附蛋白质；2热原质的去除：肠杆菌科细菌产生的内毒素，为胞壁成分脂多糖。避免产生热原质；在

无菌条件下进行操作，灭菌、低温；采用阴离子交换吸附、疏水层析和亲和层析去除。3病毒的去除：色谱分离、紫外线照射为阴离子物质为疏水性物质以多粘菌素B、变形细胞溶解物七、选择分离纯化方法的依据1根据产物表达形式来选择；2根据分离单元之间的衔接选择；3根据分离纯化工艺的要求来选择。本节重点基因工程

药物制备的一般程序。真核基因在大肠杆菌中的表达形式。基因工程药物分离纯化的一般流程。理解酵母表达体系和大肠杆菌表达体系的特点。