【文档说明】抗菌药物筛选的实验方法与技术教案课件.ppt，共(31)页，1.409 MB，由小橙橙上传

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抗菌药物筛选的实验方法与技术教案2023/3/162023/3/162023/3/162023/3/162023/3/162023/3/162023/3/162023/3/164，培养基的灭菌高压蒸汽灭菌是微生物学实验、发酵工业生产、以及外科手术器械等方面最常用的一种灭菌方法

。（1）打开灭菌锅盖，加适量水；（2）将待灭菌物品放入灭菌桶内。（3）将盖上的软管插入灭菌桶的槽内，加盖，上下螺栓口对齐，均匀旋紧螺栓，使锅密闭。（4）打开放汽阀，加热，自锅内开始产生蒸汽后再关紧放汽阀，待压力逐渐上升至所需温度时，控

制热源，维持所需压力和温度，并开始计时20min后停止加热。（5）待压力降至接近0时，慢慢打开放汽阀(排汽口)，开盖，立即取出灭菌物品。2023/3/165，斜面和平板的制作将巳灭菌装有琼脂培养基的试管，趁热置于木棒上，使成适当斜度，凝固

后即成斜面(图1-3)斜面长度不超过试管长度1/2为宜。2023/3/16平板的制作2023/3/166，斜面培养基接种斜面培养基接种法一般不用作分离培养，仅使细菌繁殖为菌种传代或观察其某些生化特性之用

。(1)接种灭菌(2)开启棉塞(3)管口灭菌(4)挑起菌苔(5)接种(6)塞好棉塞。2023/3/167，液体培养基接种法2023/3/16三、微量稀释法体外抗菌实验❖连续稀释法（试管稀释法）通常用于测定微生物的最小抑菌浓度（MIC），即将微生物的浓度按几何级数或

数学级数进行递减稀释，然后将不同浓度的微生物混入含试验菌的液体培养基或固体培养基中，经培养后，能抑制试验菌生长的最低浓度，即为该微生物的最小抑菌浓度。❖微量稀释法此种方法常用于测定细菌对药物敏感性或新药对细菌的抗菌活性试验。一般应

用96孔微量稀释板，孔底呈U型，每孔容量为0.20-0.30ml。本法操作较便，用培养基量少，可作大批量药敏试验。2023/3/16(一）实验过程（1）实验菌的准备。选取大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌

(Staphylicoccusaureus)、白色葡萄球菌(Staphylococcusalbus)、蜡状芽孢杆菌菌种在营养琼脂斜面培养基上传代培养一次后，再将其接种至营养肉汤培养基中37℃培养6-12h，冰箱备用。（2）抗菌化合

物的初步筛选，按下表取96孔培养板一块，进行编号，将44种化合物（由有机化学研究所其他教师和研究生提供）用DMSO或蒸馏水配制成50mol/ml，（也可用无菌过滤器过滤后）放置在灭菌的小离心管中。2023/3/16筛选实验过程（

3）在超净工作台内，酒精灯下，将液体培养的细菌菌种用培养液进行稀释，稀释度为1：1000或1:500。用无菌的移液器（吸咀经过灭菌处理）将稀释的液体菌种198l加入到除了A1,B1以外的孔内，2l各种化合物溶液（DMSO

配置），A1,B1,C1,D1加200l培养液，震荡混合后37℃培养12h-18h,用酶标仪630nm侧吸光度。DMSO的最终浓度保持在1%。每个样品设两个平行孔。2023/3/1696孔细胞培养板加样安排123456789101112A培养液200l样品12345678910

11B培养液200l样品1234567891011C培养液200l样品1213141516171819202122D培养液200l样品1213141516171819202122E菌对照(2lDMSO)样品232425262728

2930313233F菌对照(2lDMSO)样品2324252627282930313233G菌对照(2lDMSO)样品3435363738394041424344H菌对照(2lDMSO)样品3435363738394041424344样品浓

度0.02mmol/ml样品分子量/100.mg用DMSO配成0.5ml即可，每次实验用2l，96孔板的孔体积200l，样品的最终浓度为200mol/L，大于该浓度则无价值。2023/3/16试验用样品1.环丙沙星2.2,4,3-三羟基二苯甲酮3.2,4,4-三羟基二苯甲酮4.2,4,

2-三羟基二苯甲酮5.2,3,4,2-四羟基二苯甲酮6.2,3,4,3-四羟基二苯甲酮7.2,3,4,4-四羟基二苯甲酮8.2,4,2,4-四羟基二苯甲酮9.2,3,4,2,4-五羟基二苯甲酮10.丹皮酚11.丹皮酚-镍（II）配合物12.丹皮酚-氧钒（V）配合物13.丹皮酚

-铜（II）配合物14.丹皮酚-钴（II）配合物15.丹皮酚-锰（II）配合物16.丹皮酚-锌（II）配合物17.苯甲基-N-苯基亚胺18.3-羟基苯甲基-N-苯基亚胺19.4-羟基苯甲基-N-2,4-二甲氧基苯基亚胺20.2-羟基苯甲基

-N-3,5-二苯基亚胺21.3,4-二羟基苯甲基-N-苯基亚胺22.4-羟基苯甲基-N-3,4-二甲氧基苯基亚胺23.4-羟基-3-甲氧基-N-2,4-二甲氧基苯基亚胺24.苯甲基-N-4-羟基苯基亚胺25.3,4-二羟基苯甲基-N-2,4-二甲氧基苯基亚胺26.4-羟基苯甲

基-N-4-羟基苯基亚胺27.3,5-二羟基苯甲基-N-3,4-二甲氧基苯基亚胺28.2,5-二羟基苯甲基-N-4-羟基苯基亚胺29.2,4-二羟基苯甲基-N-4-羟基苯基亚胺30.2,4-二羟基苯甲基-N-2,4-二甲氧基苯基亚胺31.4-羟基苯甲基-N-3-羟基苯基

亚胺32.3,5-二羟基苯甲基-N-2,4-二甲氧基苯基亚胺33.4-羟基-3-甲氧基-N-3,4-二甲氧基苯基亚胺34.4-羟基苯甲基-N-4-甲基苯基亚胺35.4-羟基-3-甲氧基苯甲基-N-4-甲基苯基亚胺36.3,5-二羟基苯甲基-N-4-甲基苯基亚胺37.2,4

-二羟基苯甲基-N-4-甲基苯基亚胺38.4-磺酸基-3,4-二羟基偶氮苯39.4-磺酸基-2,4-二羟基偶氮苯40.4-硝基-3,4-二羟基偶氮苯41.4-硝基-2,4-二羟基偶氮苯42.4-硝基-2,5-二羟基偶氮苯43.4-溴-3,4-二羟基偶氮苯44.

对羟基苯甲酸甲酯2023/3/16筛选数据分析测试的样品中，1号样为市场上临床使用的环丙沙星，浓度为0.005mmol/L。其他样品浓度为0.02mmol/L。实验中，以培养基为空白0%，以带菌培养液为对照100%。如果酶标仪630nm测试的结果中，空白为-0.2，空内液体呈透明清澈，对照孔的值为

+0.1-0.2。如果测试样品的值也同样达到-0.2，表明样品在200mol/L具有较好的抗菌活性。如果测试样品的值在对照孔和空白之间，表明样品在高浓度有抗菌作用，请选取11个抗菌效果较好的样品做下面的最小抑菌浓度实验。2023/3/16筛选数

据分析测试的样品中，1号样为市场上临床使用的环丙沙星，浓度为0.005mmol/L。其他样品浓度为0.02mmol/L。实验中，以培养基为空白0%，以带菌培养液为对照100%。如果酶标仪630nm测试的结果中，空白为-0.2，空内液体呈透明

清澈，对照孔的值为+0.1-0.2。如果测试样品的值也同样达到-0.2，表明样品在200mol/L具有较好的抗菌活性。如果测试样品的值在对照孔和空白之间，表明样品在高浓度有抗菌作用，请选取11个抗菌效果较好的样品做下面的最小抑菌浓度实验。2023/3

/16（4）最小抑菌浓度或EC50的测试❖操作步骤与试管稀释法相似，一般常用MH培养基，根据上面筛选试验选取出来的样品，在微孔板孔内用微量移液器直接在微孔板孔内作二倍稀释，然后接种稀释菌液，其中留一列孔作为药液对照，另一孔仅加培养基和菌液作为菌对照，试验完毕后，用微

量搅拌器震荡混匀后，置37℃温孵12-18h，用酶标仪630nm侧吸光度。2023/3/16样品稀释后的浓度表A培养液200l样品1，200M234567891011B培养液200l样品1，100MC培养液200l样品1，50

MD培养液200l样品1，25ME菌对照(2lDMSO)样品1，12.5MF菌对照(2lDMSO)样品1，6.25MG菌对照(2lDMSO)样品1，3.13MH菌对照(2lDMSO)样品1，1.56M2023/3/16（二）数据处理与分析抗菌药物的最小抗菌浓度测试结

果可能出现两种形式：1，在某一个稀释的样品浓度，结果表现出细菌没有生长，菌液较清（可与空白培养基比），而下一个稀释的样品浓度，菌液中细菌生长比较旺盛（可与含菌对照比），那么，这个稀释的样品浓度就为该样品抗菌的最小浓度。这

种化合物的抗菌作用可以称为杀菌作用。如右表中红色值中的样品浓度就是最小抗菌浓度。培养液值-0.2013样品1值-0.2094样品2值-0.2066培养液值-0.2027样品1值-0.2102样品2值-0.210

3培养液值-0.2005样品1值-0.2068样品2值-0.2112培养液值-0.2106样品1值-0.2054样品2值-0.2022菌对照值0.2182样品1值-0.2028样品2值0.2087菌对照值0.2068样品1值-0.2008样品2值0.211

2菌对照值0.2146样品1值0.2023样品2值0.2088菌对照值0.2033样品1值0.2036样品2值0.20332023/3/162，实验中，不同稀释的样品浓度的测试结果没有上面的现象，而是出现规律性的上升。即，这种样品测出的数据是随着样品浓度的下降而上升，可以根据其数据画出

一条细菌的生长曲线，如果对照样的值定为100%，可以从曲线上求出抑制50%时样品的浓度，所以，我们称这种抗菌为抑菌作用，表明该化合物不能杀死细菌，但可以抑制其生长。培养液值-0.2013样品1值-0.2194样品2值-0.2166培养液值-0.2027样品1值-0.2082样品2值-0.

1893培养液值-0.2005样品1值-0.1694样品2值-0.1002培养液值-0.2106样品1值-0.1268样品2值0.0022菌对照值0.2182样品1值-0.0428样品2值0.0587菌对照值0.2068样品1值-0.0023样品2值0.1612菌对照值0.

2146样品1值0.6804样品2值0.2088菌对照值0.2033样品1值0.1389样品2值0.21332023/3/16四、琼脂扩散法❖此种方法包括纸片法，杯碟法．挖洞法等，它们的共同点均在平皿琼脂内加入适量

测试细菌，按上述方法放置适量药液在菌层上，药物在琼脂四周扩散，经孵育后，细菌生长受抑制，出现抑菌圈，测定抑菌圈直径，能了解细菌对药物的敏感程度。❖琼脂扩散法可定性或初步判断该化合物的抗菌能力，一般是将化合物稀释后，加如含试验菌的混菌

平板中，由于化合物在琼脂培养基中的扩散作用，使化合物周围的试验菌不能生长，从而产生抑菌圈或抑菌带。根据抑菌圈或抑菌带的大小来评价化合物抗菌作用的强弱。2023/3/16图:标准曲线法图：链霉素标准曲线双碟、钢管与抑

菌圈位置图S：标准品T：供试品抑菌圈直径(mm)2023/3/16（一）滤纸片法实验过程（1）试验菌的准备。在营养培养基接种金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌种培养传代依次后，再移种至营养肉汤培养基中，在37℃培养10-18h，取出备用。（2）混菌平板的植被。用无菌吸管分别取金

黄色葡萄球菌和大肠杆菌的肉汤培养物，在无菌平皿中各滴加4-5滴，再将已溶化并冷却至45℃的琼脂培养基倒入平皿中，每皿20mL，立即晃动平皿混匀，平放台上，凝固后备用。（3）用记号笔在无菌平皿底部划十字线，将平板分为四-六个区，每一个区上标注加入药品名称。（

4）用无菌镊子取无菌滤纸片（直径6-8mm），浸入待测药液（可以稀释成4-6不同浓度），然后轻轻放入混菌平板对应的区域中央，贴紧（如图）。（5）将平皿放入37℃恒温箱中倒置培养20h，然后观察结果。（6）用卡尺测量抑菌圈的直径，以判断微生物的抑菌能力。20

23/3/162023/3/16效果评价❖抑菌圈直径≥15mm高度敏感❖抑菌圈直径10-15mm中度敏感❖抑菌圈直径≤10mm低度敏感❖无抑菌圈不敏感或耐药2023/3/16四、实验安排每周四上午，先进行抗菌药物的筛选

，然后进行培养基的配制、灭菌，斜面和液体试管培养的制作及接菌，为第二天的实验做准备。每周五上午，用酶标仪进行抗菌药物的测定，然后进行最小浓度测试和琼脂扩散法测试实验。每周六上午9时，用酶标仪检测最小抑菌浓度和抑菌圈测试。由指导教师预先进行细菌试管液体培养18-20小时

，为后续实验做准备。123谢谢您的欣赏