第17讲-抗生素发酵生产工艺学课件

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以下为本文档部分文字说明:

2021/3/281第17讲抗生素发酵生产技术AntibioticsFermentationProduction2021/3/2821.概述;2.生产前期研究;3.生产菌改良;4.生产工艺过程;5.发酵条

件的控制;6.提取和精制.主要内容2021/3/283生存竞争说:共生与拮抗,抗生素是拮抗菌分泌的用来与别的微生物战斗的武器。代谢说:抗生素的产生是由于生物的代谢功能,而抗生素的抗生现象,只是其作用表现。证据:生产中一定要求纯培养;抗生素生产一般不用诱导物;抗

生素生产可加入一些前体;某些微生物在人工合成的培养基才能生产抗生素;有时抗生素的生产也不一定使菌体达到竞争的目的。1.1抗生素的生物起源1.概述2021/3/2841.2抗生素的定义和命名(1)抗生素的定义早期:一般认为来源于微生物,且主要作用于细菌感染

。故认为抗生素(antibiotics)是微生物在代谢过程中产的,在低浓度下就能抑制它种微生物生长和活动,甚至杀死他种微生物的化学物质。由于抗生素的这种杀菌能力,我们曾经把这类物质叫做抗菌素。2021/3/285现在:来源:随着抗生素研究和生产的发展,

新的抗生素的来源正在扩大。可以是微生物、植物(如蒜素、常山碱、黄连素、长春花碱、鱼腥草素等)、动物(如鱼素、红血球素等)。但抗生素的工业化生产主要是来自微生物的大量发酵法,微生物是抗生素舞台上的主角。作用对象:

病毒、细菌、真菌、原生动物、寄生虫、藻类、肿瘤细胞等。因此不能把抗生素仅仅作为抗菌药物。2021/3/286定义:虽然抗生素已被广泛使用,但是由于抗生素的多样性,关于抗生素的定义在专家中一直存在着分歧。目前,一个大多数专家所接受的定义

是:抗生素是由生物(包括某些微生物、植物和动物在内)在其生命活动过程中产生的,能在低浓度下有选择地抑制他种生物机能的低分子量的有机物质。狭义的定义是:抗生素是低分子量的微生物代谢产物,能在很低的浓度下抑制其他微生物的生长。2021/3/287掌握狭义的抗生素这个概念,需要把握以下几点:A、低

分子量分子量一般不超过几千。如溶菌酶这类酶及其他复杂的蛋白质分子虽然也具有抗菌活性,但由于它们的分子量很大,因而在习惯上不将它们归入抗生素一类。2021/3/288B、天然代谢产物只有微生物的天然代谢产物才能称为抗生素,通过化学修饰的只能称为半合成抗生素,根据天

然抗生素的结构完全采用化学合成方法制造的则称为全合成抗生素。C、抑制其他微生物生长是指抑制细胞的繁殖,因此是针对微生物群体而不是个别细胞而言的。这种抑制作用一类是永久性的,例如杀细菌剂和杀霉菌剂等可以将微生物杀死;另一类抗生素只能起到抑制微

生物繁殖生长的作用,但不能将它们杀死。2021/3/289D、低浓度因为在高浓度下,即使是正常的细胞组分,如甘氨酸和亮氨酸,也会对细菌的生长产生抑制作用。基于同样的理由,一些厌氧发酵产物,如乙醇和丁醇,虽然在高浓度下也有杀菌或抑菌作用

,也不属于抗生素。典型的抗生素的抗菌活性非常高,只要在微摩尔甚至纳摩尔浓度时就会有显著的抗菌活性。自从A.Fleming于1929年发现第一种广泛用于医疗上的抗生素以来,至今已找到1万种以上新抗生素(1984)和合成了7万多种的半合成抗生素,但真正

得到临床应用的常用抗生素仅约五六十种。2021/3/28101.3抗生素的发展简史▪历史▪1929年,英国弗莱明发现青霉素▪二战期间,大规模发酵生产▪世界上最早用于临床的抗菌素2021/3/2811治疗和发展我国的发

展:1953年5月1日,建立了第一个生产青霉素的抗生素工厂(上海第三制药厂);1958年6月3日,最大的抗生素联合企业建成投产(华北制药厂,石家庄)目前,多为原料药基地。但在半合成及成品药的剂型方面与国外相比差距很大。2021/3/28121.4抗生素的分类抗

生素的分类主要是便于研究,不同学科和科研人员因出发点不同有不同的分类体系。可根据生物来源、作用对象、化学结构、作用机制、生物合成途径等方面对抗生素进行分类。2021/3/28131.4抗生素的分类1.4.1根据抗生素的生物来源分类(生物学家)(1)放线菌产生的抗生素:如链霉素、四环类(如四环素)、

大环内酯类(如红霉素)、多烯类(如制霉菌素)、放线菌素类(如放线菌素D)等。(其中链霉菌属最多,诺卡氏菌属、小单孢菌次之)(2)真菌产生的抗生素:如青霉菌属和头孢菌属等分别产生一些很重要的抗生素(青霉素、灰黄霉素、头孢菌素)。2021/3/2814(3)细菌产生的抗生素:如多粘杆菌、枯草杆菌、芽孢

杆菌等。如多粘菌素。(4)植物或动物产生的抗生素:从被子植物蒜中制得的蒜素;从动物脏器中制得的鱼素等。2021/3/28151.4.2根据抗生素的作用对象分类(医生、病理学家)(1)广谱抗生素:如氨卞青霉素既抑制G+,又抑制G-(2)抗G+的抗生素:如青霉素,(3)抗G-的抗

生素:如链霉素(4)抗真菌的抗生素:如制霉菌素(5)抗病毒的抗生素:如四环类抗生素对立克次氏体及较大病毒有一定作用。(6)抗癌的抗生素:如阿霉素2021/3/28161.4.3根据抗生素的化学结构分类(化学家)目前已确定结构的抗生素习惯如下分类:(1)β-

内酰胺类抗生素:包括青霉素类,头孢菌素类等;(2)氨基糖苷类抗生素:包括链霉素、庆大霉素等;(3)大环内脂类抗生素:如红霉素、麦迪加霉素;(4)四环类抗生素:如四环素、土霉素;(5)多肽类抗生素:如多粘菌素、杆菌肽;(6)蒽环类抗生素:如阿霉素、柔红霉素;(7)喹诺酮类抗生素:如环丙沙星、诺氟沙

星。2021/3/2817β-内酰胺环2021/3/2818β-内酰胺环2021/3/2819两性霉素Antibioticsaresocomplextheycanonlybesynthesizedinalivingsyst

em2021/3/28201.4.4根据抗生素的作用机制分类此种分类的优点:便于进行理论研究,有助于了解抗生素影响病原体新陈代谢的哪些环节,从而找出治疗的规律,使抗生素的使用更为合理。(1)抑制细胞壁合成的抗生

素:如青霉素。(2)影响细胞膜功能的抗生素:多烯类抗生素。(3)抑制病原菌蛋白质合成的抗生素:四环素。(4)抑制核酸合成的抗生素:如影响DNA结构和功能的丝裂霉素C。(5)抑制生物能作用的抗生素:如抑制电子转移的抗霉素。2021/3/28211.

4.5根据抗生素的合成途径分类(1)氨基酸、肽类衍生物抗生素:如青霉素类、头孢菌素等寡肽抗生素。(2)糖类衍生物抗生素:如链霉素等糖苷类抗生素。(3)以乙酸、丙酸为单位的衍生物抗生素:红霉素等丙酸衍生物。问题:一种抗生素可能有几种机制,机制非常清楚的不多。

2021/3/28221.5抗生素的剂量表示法及抗菌谱1.5.1抗生素的剂量表示法抗生素应用时剂量小,因此除重量外,常用特定的效价单位表示(1)稀释单位:无法制得纯品,最初的表示方法,一定基于稀释法定的基准单位。一个青霉素的效价单位:为能在50mL肉汤培

养基中完全抑制金黄色葡萄球菌标准菌株的发育的最小青霉素剂量。一个链霉素效价单位:能在1mL肉汤培养基中完全抑制大肠杆菌(ATCC9637)发育的最小剂量。2021/3/2823(2)重量单位:以抗生素的有效成分(生理活性成分)的重量作为抗生素的基准单位。(大多数

使用)一般定义1mg=1400单位。对于各种酸、碱、盐,指定其中的一个。如链霉素、氯霉素等以游离碱计,又如金霉素、氯霉素以盐酸盐计。2021/3/28241.6抗生素的体外抗菌作用判断药物有无抗菌作用及其抗菌作用的强弱,有体外和体内两种试验

方法。一般先进行体外抗菌试验,若发现药物有抗菌作用,可再进行体内抗菌试验。体外抗菌试验主要用于筛选抗菌药物或测定细菌对药物的敏感性,所以也称为药敏试验,常用最低抑菌浓度(MIC)表示,是指药物完全抑制某种微生物的最低浓度。(1)抑菌、杀菌作用抑菌作用:抗生素存在

时细菌的繁殖受到抑制,去除抗生素后,对细菌的抑制作用消失。杀菌作用:对细菌的不可逆损害,导致死亡。(2)菌种的最低药物敏感度测定。2021/3/2825最小抑菌浓度(MIC):培养24h以最低浓度无菌体生长者。用来表示抗生素的抗

菌活性作用,单位是µg/mL。最小杀菌浓度(MBC):次代继续孵化24h以最低浓度无菌生长者。即当药物浓度在稍高于MIC值浓度下的抑菌作用是不可逆的,称为杀菌作用。最低抑菌浓度与最低杀菌浓度可以相同,也可以有所不同。最低杀菌浓度的确定即

依次将未见细菌生长的各管培养物各吸取0.1mL涂布于合适的琼脂培养基平板上,在规定的温度下培养18~24h,平板上的菌落数小于5个的最小稀释度的药物浓度即为最低杀菌浓度。(3)抗菌谱:某种抗生素所能抑制或杀灭病原体的范围,称之为该种抗生素的抗菌谱。2021/3/28261.7医疗用抗生素应

具备的条件(1)抗生素在低浓度下对多种病原菌有效—高效(2)难以使病原菌产生耐药性—交叉用药,防止最重要(3)较大的差异毒性——副作用小2021/3/2827▪产生菌的筛选;▪抗菌性试验;▪提取、精制、鉴定;▪毒性试验;▪药理和临床试验。2.生产前期研究2021

/3/2828agarplate琼脂培养基lawnoftestbacteria测试菌苔filterpaperssoakedwithtestcompounds含药物滤纸zonesofinhibition(nogrowth)抑菌圈2021/3/2829分析仪器Analyticalinstruments

现代分析仪器:•核磁共振•毛细管电泳•气相色谱•高效液相色谱•质谱Modernanalyticalinstruments:▪Nuclearmagneticresonance(NMR)▪Capillaryelectrophoresis(CE)▪Gaschromatography(GC)▪Highp

erformanceliquidchromatography(HPLC)▪Massspectroscopy(MS)AutomationSensitivityAccuracy自动灵敏准确2021/3/2830人

工诱变法:紫外线、X-线、r-线照射亚硝基胍、亚硝酸、秋水仙素、氮芥等诱变剂处理3.抗生素生产菌改良2021/3/2831基因工程GeneticEngineeringRecombinantDNATechnology

(DNA重组技术)克隆2021/3/2832StrainImprovementScale-upStrain出发菌株Agarplate平板技术PrimaryshakeflaskEvaluation摇瓶培养Secondaryshakeflaskevaluationdifferen

tmedia二级摇瓶培养各种培养基LabfermentorevaluationProductionCondition小型发酵罐模拟生产条件MastercellbankWorkingcellbankInoculumDevelopment菌种扩大培养PilotplantEva

luation中试生产ProductionEvaluation生产60003003031Possiblerecycle2021/3/2833Scale-up(比拟放大)modelsELGaddenJr<10dm3▪Goodproduct▪Goodproductivity>200m3•Same

productivity?•Limitations?模拟2021/3/2834摇瓶发酵Shake-flaskfermentation•装液量:10%(-250ml)•间歇培养•温控受限制•代谢碳水化合物慢•常压

•缓冲液控制pH•在线取样难•容量减少•瓶壁上结垢•无需消泡•搅拌受限制•无法控制溶解氧2021/3/2835搅拌罐发酵Stirredtankfermentation•10-100,000升容量•间歇和补料培养•连续控制:pH,温度•需要铵盐或氨气•2大气压•无需缓冲液•在线

取样易•补料,容量增加•生长均匀一致•需消泡•多种搅拌•控制溶解氧:通气,加压2021/3/2836摇瓶发酵Shake-flask•装液量:10%(~250ml)•间歇培养•温控受限制•代谢碳水化合物慢•常压•缓冲液控制pH•在线取样难•容量减少•瓶壁上结垢•无需消泡•搅拌受限制•无法控制

溶解氧•10-100,000升容量•间歇和补料培养•连续控制:pH,温度•需要铵盐或氨气•2大气压•无需缓冲液•在线取样易•补料,容量增加•生长均匀一致•需消泡•多种搅拌•控制溶解氧:通气,加压搅拌罐发酵Stirredtank2021/3/283

7菌种→种子制备→发酵→发酵液预处理→提取及精制→成品包装4.抗生素生产工艺过程AntibioticsProductionProcessing2021/3/2838Aschemeofthemateria

lflowinanantibioticproduction连消发酵罐缓冲罐种子罐2021/3/2839发酵生产原料MaterialsforFermentationCarbonsource:•Beet&canemolasses•Glucose,lactose,starch•Ethanol,met

hanol•Glycerol•Maltosesyrup,cornsyrup•Cottonseedoil,peanutoil,soyoil•Lardoil•Methyloleate•Tallow碳源:•甜菜和甘蔗糖蜜•葡萄糖,乳糖,淀粉•乙醇,甲醇•甘油•麦

芽糖浆,玉米糖浆•绵籽油,花生油,豆油•猪油•油酸甲酯•油脂2021/3/2840氮源:•绵籽粉•玉米粉和玉米浸出液•大豆粉和大豆面•花生粉•菜籽粉•牛血,酪蛋白水解液•乳清•鱼粉•酵母•酵母膏•肉粉和骨粉Nitrogensource:•Cotton

seedmeal•Cornmeal&steepliquor•Soybeanmeal&flour•Peanutmeal•Rapeseedmeal•Beefblood,Caseinhydrolysate•Whey•Fis

hmeal•Wholeyeast•Yeastextract•Meat&bonemeal发酵生产原料MaterialsforFermentation2021/3/2841培养基MediaforCellGrowth&FinalproductionCom

ponentsRange%组成Glucose/sucrose3.0-5.0葡萄糖/蔗糖Starch淀粉3.0-5.0Cornsteepliquor3.0-5.0Calciumcarbonate0.5-1.0

碳酸钙Phosphate磷酸盐0.1-0.5Ammoniumsulphate0.1-1.0硫酸胺Urea尿素0.1-0.5Oil油0.1-0.5Fermentation发酵培养基ComponentsRange%组成Glucose0.5-1.0Starch0.5-5.0Cornsteepliquor

5.0-8.0玉米浸提液Soyflour1.0-5.0Phosphate0.1-1.0Ammoniumsulphate0.5-1.0andfedperiodicallyOil1.0andfedcontinuouslyCornsyrupfedcontinuously玉米

糖浆连续加料Tankseed种子培养基2021/3/2842StirredtankFermentation搅拌发酵tpogoCgFogiColollkACVorolsClcVtoloC2021/3/2843

5.发酵控制FermentationControlPressureprobeLevelprobepHprobeTemp.probeDOprobeAntifoamAcid/BaseCoolingAir/agitationSugar/Oilfeed20

21/3/2844ScaleWeightSignalPumpSpeedAmplifierControllerSupervisoryComputerFlowRateControl流量控制2021/3/284

5发酵控制Fermentationcontrol2021/3/2846▪菌种(strain):产黄青霉菌(Penicilliumchrysogenum)▪孢子培养(sporecultivation):25ºC,6-7d▪种子培养(seedcultivation):25ºC,2-3d▪

发酵培养(fermentation):22-26ºC,6-7d▪加糖控制(sugarfeeding):残糖降至0.6%青霉素发酵(1)PenicillinFermentation2021/3/2847▪补氮(nitrogenfeeding):氨控制在

0.01-0.05%▪前体(precursor):残余苯乙酰胺0.05-0.08%▪温度控制(temperature):前期25-26ºC后期23ºC▪通气与搅拌(aeration&stir):1:0.8VVM▪泡沫(foam):天然油脂,如豆油青霉素发酵(2)PenicillinFerm

entation2021/3/2848PenicillinFermentationProfile变化曲线2021/3/2849生产方法:6.1、生物合成法:①传统方法②“工程菌”制造法③细胞融合技术法6.2、化学合成法;6.3、生物合成加化学合成法。6抗生素的生产方法2

021/3/28506.1、生物合成法:①传统方法大多数抗生素是由放线菌和霉菌产生的。菌种是通过从土壤中分离、筛选获得,一般采用深层通风搅拌发酵罐生产。传统方法目前存在很多不足,因此,人们采用基因工程和细胞融合技术,对抗生素产生菌进行了改造和重新设计,不仅可以

制造出许多高效低毒的新型抗生素,还可改革工艺,使抗生素产量成倍地增长。2021/3/2851②“工程菌”制造法第一次由“工程菌”制造的全新抗生素—麦迪紫红素A,是美国报道的。他们将产放线紫红素的部分基因插入产麦迪霉素的放线菌中,构建的“工程菌”产生了全新的抗生素

。我国新构建的生产丁胺卡那霉素的“工程菌”,就是把酰化酶基因克隆到卡那霉素产生菌中获得的。新的“工程菌”生产的新抗生素毒副作用小,对耐卡那霉素、庆大霉素致病菌临床疗效显著。2021/3/2852③细胞融合技术法对抗生素产生菌采用细胞融合技术的成果更为突出。橄榄色无孢小单孢菌细胞融合株抗生素产率

比原菌株提高140倍。目前DNA重组技术已广泛用于红霉素、链霉素等20多种抗生素的育种工作,可以预见不久将来会有更多的由“工程菌”生产的新型抗生素问世。2021/3/28536.2化学合成法根据某种抗生素的化学组成和结

构,通过化学合成的方法,可生产部分抗生素。如:氯霉素、磷霉素等。经过化学合成方法和控制条件的不断深入研究,越来越多的抗生素可用化学合成法生产。2021/3/28546.3生物合成加化学合成法许多细菌逐渐出现了抗药性,已经证实某些抗药性因子位于细菌内的质粒

上,质粒可以在细菌之间转移,结果抗性菌日益增多,抗生素疗效就越来越低。为了对付细菌的抗药性,科学家对原有的抗生素进行了“整容手术”,细菌因再无法识别改头换面的抗生素而被抑制或杀死。现在已能使用克隆了酰化酶基

因的“工程菌”(大肠杆菌)高效率的生产半合成抗生素。临床现在使用的贵重特效药物先锋霉素(头孢菌素类)、氨苄青霉素,就是这类半合成抗生素类药物。国外已有几十种这类药物在实验室研制成功。2021/3/2855Aschemeofthematerialflowinanantibioticprod

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