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细胞生物学研究思路基础医学细胞生物学与遗传学----肿瘤研究小组成员黄辰教授博士侯妮讲师博士刘利英高级实验师博士杨娟副教授博士陈妍珂副教授博士赵凌宇讲师博士刘颖勋讲师博士秦棪楠讲师博士郭波讲师博士王鲁敏讲师博士王晓霏实验室硕士细胞生物学与遗传学----肿瘤研究小组研究平台实验

室建设模块大型仪器检测室普通功能实验室动物饲养室形态学检测细胞生物学分子生物学流式细胞仪激光共聚焦显微镜图像分析系统定量PCR膜片钳蛋白组学芯片点样杂交系统激光捕获显微切割系统小动物活体成像系统动物行为学细胞生物学与遗

传学----肿瘤研究小组实验环境➢技术集成（开设高端生物医学实验课程）➢一站式的科研基地（实现功能实验室与大型仪器联动）➢严格管理与人性化统一➢宽松学术氛围与严谨科学态度细胞生物学与遗传学----肿瘤研究小组研究方向1.心理

应激与疾病➢建立了恐惧声音心理应激模型➢探索了心理应激与肿瘤发生关系➢探索了心理应激对学习记忆的生物学效应➢探索了心理应激对雄性生殖的生物学效应细胞生物学与遗传学----肿瘤研究小组研究方向2.肿瘤发生发展机制➢非编

码RNA与肿瘤的关系➢肿瘤的表观遗传学调控机制（MECP2）➢RNA结合蛋白、mRNA与非编码RNA的相互作用在肿瘤中的网络调控细胞生物学与遗传学----肿瘤研究小组研究方向3.生物标志物筛选➢肿瘤血清标志物的筛选➢自闭症血清标志物的

筛选➢高原习服标志物的筛选W1\0_B1\1\1SLin,Smoothed,Baselinesubt.02464x10Intens.[a.u.]W2\0_B3\1\1SLin,Smoothed,Baselinesubt.0

2464x10Intens.[a.u.]100020003000400050006000700080009000m/z细胞生物学与遗传学----肿瘤研究小组研究方向4.糖修饰组学在疾病中的作用➢肿瘤糖修饰组学➢自闭症糖修饰组学➢高原习

服糖修饰组学科学研究是科学工作者的幸福源泉•幸福就在于人的感性生活，在于感性欲望的满足与快乐。•幸福的过程有神经递质的释放（多巴胺与内啡肽）。•科学研究的幸福可以自我掌控。为什么科学研究是一种痛苦？课题死了么？1.结论已经发表2.推理已经证实3.技术已经应用4.实验无法

实现5.时间不够用发散思维从科学的痛苦到科学的幸福的基础创新性可读性信息量文献内容•解决问题•创新之处•意义所在•技术实现•文章理念•文献内容是否支持作者观点自身研究•研究方向•最终目标•实验技能•课题技巧思考消化如何将科学研究的痛苦变成幸福？跟踪性研究思路横向移植的研究纵向连接的研究ABE

ACEADE…………AB源头跟踪模仿BC源头跟踪模仿ABC将科学研究变得简单研究思路——跟踪性研究思路发现某基因在肝癌组织中表达增高，并有很多机制研究样本差异查文献后，确定在乳腺癌中尚无人涉及。SCI处女作出炉：

某基因在乳腺癌组织中表达增高。已发表内容自身研究内容研究思路——跟踪性研究思路发现辛伐他汀有某种作用，能够治疗某种临床疾病，且对其原理进行了研究，找到了相关基因。药物处理差异联想到了阿托伐他汀。SCI处女作出炉：阿托伐他汀对某疾病的治疗效果及其作用机制。

已发表内容自身研究内容研究思路——跟踪性研究思路发现某基因具有抗氧化应激的作用机制相似性联想到氧化应激在好多疾病的病理机制中都发挥作用，比如糖尿病肾病、糖尿病神经病变等等。SCI处女作出炉：某基因在糖尿病肾病中的作

用。已发表内容自身研究内容研究思路——跟踪性研究思路发现A基因具有某种作用。信号通路联想到A基因的上游或下游基因是B基因，是否也有这种作用？SCI处女作出炉：B基因具有某种作用。已发表内容自身研究内容研究思路——跟踪性研究思路问题1：肿瘤的表观调控研究思路——跟踪性研究思路问题2：MeCP2在胃

癌中的作用如何？研究思路——跟踪性研究思路问题3：什么分子调控了MeCP2？研究思路——跟踪性研究思路问题4：MeCP2调控了什么分子？染色质免疫共沉淀(CHIP-on-chip)研究思路——跟踪性研究思路假设与结果研究思路——跟踪性研究思路发现某种药物能够对TN

F-α产生影响。家族基因拜读大作后，联想到IL-6以及CRP都是炎症因子，有可能这种药物对IL-6以及CRP也有影响。SCI处女作出炉：某种药物对IL-6以及CRP的影响。已发表内容自身研究内容研究思路——基于技术跟踪的新探索各种组学不同样本不同处理生物信息

分析靶分子验证问题的解释研究思路——基于技术跟踪的新探索收集临床样本RNADNAProteinmicroRNA芯片基因芯片组织芯片RT-PCR或Real-timePCRWestern-blot免疫组化基因表达差异确定目的基因参考文献microRNA研究研究思路——基于技术跟踪的新

探索问题1：自闭症诊断困难兴趣范围狭窄和刻板的行为模式语言交流障碍社会交往障碍研究思路——基于技术跟踪的新探索问题2：自闭症的遗传因素复杂研究思路——基于技术跟踪的新探索问题3：为什么自闭症有共同的特

征？研究思路——基于技术跟踪的新探索问题4：如何寻找自闭症的生物标志物？生物芯片或磁珠化学芯片或磁珠疏水芯片阳离子交换金属芯片亲水芯片抗原-抗体受体-配体DNA-Protein阴离子交换PS10orPS20ChoosediseaseBothtumorpatientsandhealthcontrol

sCollectingsamplesserum……SamplequalityisveryimportantBloodsampleswerecollectedbytrainedphlebotomist,andprocessedwithinafewhoursaccor

dingtoastandardprotocol.Aliquotsofseraformassspectrometricanalysiswerefrozenat-80℃immediatelyafterprocessing.Separationpro

teinsbyTheliquidchipClinProtBeadsClinProtBeadsClinProtBeadshydrophobicityMB-HIC1MB-HIC3MB-HIC8MB-HIC18weaka

nionandweakcationMB-WCXMB-WAXmetalionsMB-IMAC-FeMB-IMAC-CuMassspectrumanalysisW1\0_B1\1\1SLin,Smoothed,Baselinesubt.02464x10Intens.[a.u.]W2\

0_B3\1\1SLin,Smoothed,Baselinesubt.02464x10Intens.[a.u.]100020003000400050006000700080009000m/z峰质量变化倍数基因名称鉴定序列4

3881.971.78SERPINA5SARLNSQRLVFNRPFLMFIVDNNILFLGKVNRP64089.211.61FGAGDSTFESKSYKMADEAGSEADHEGTHSTKRGHAKSRPV84208.051.73ASLFVAEFLF

WASLCM*THLSRM*AEDLILYCTKEFSFVQ表1串联质谱鉴定的可能的ASD相关蛋白*d2-good'''''\0_L2\1\1SLin,Smoothed,"Baselinesubt."0250500750Inten

s.[a.u.]*d2-good''''''\0_L2\1\1SLin,Smoothed,"Baselinesubt."02505007501000Intens.[a.u.]*d2-good''''\0_L2\1\1SLin,Smoothed,"Baseline

subt."0200400Intens.[a.u.]*12'''''''\0_L11\1\1SLin,Smoothed,"Baselinesubt."05001000Intens.[a.u.]*12'''''''''\0_L11\1\1SLin

,Smoothed,"Baselinesubt."05001000Intens.[a.u.]*12''''''''\0_L11\1\1SLin,Smoothed,"Baselinesubt."05001000Intens.

[a.u.]100020003000400050006000700080009000m/zl0500100015002000Intens.[a.u.]100020003000400050006000700080009000m/zPk3,78

6Da020406080100120051015202530354045505560657075Pk7,810Da研究结果新的问题或未解决的问题所有技术为我所用研究思路——基于新现象观察下的新探索基因功能的分析基因

功能研究目的基因表达调控细胞水平动物水平活性周期运动分化衰老凋亡……….模式动物药物处理临床样本收集组织水平动物组织稳定细胞系药物处理成瘤实验……….免疫组化qPCRWB……….按照论文结构的实验设计分子准备工作、前期初步实验结果引入细胞

/组织水平现象作用机制切入作用机制深入可选：1.模式细胞/动物验证2.旁通机制3.临床样本验证4.模式图Diagram123456qPCRWBWBWBRNAiIFFCMIHCDrugsMorphology基因突变与沉默技术——RNAi1990年，Jorgensen将色素的基因导入矮牵牛(pe

tunias)，发现了共抑制现象(cosuppression)。1995年，Guo等应用parI基因的反义RNA处理线虫产生了parI基因功能缺失型或基因敲除型的表型。1998年，Fire和Mello证实Guo发现的正义RNA或反义RNA诱导基因表达抑制是由微量dsR

NA而引起。提出RNA干涉(RNAinterference,RNAi)的概念。基因突变与沉默技术——RNAiDouble-strandedRNAinjectC.elegansNeg.controlUninjectedAntisenseRNAdsRNAsenseantisen

seNature1998391:806-811Mex-3mRNAdetectioninembryosbyinsituhybridizationAndrewZ.Fire(StanfordUniversityphoto

)CraigC.Mello(UniversityofMassachusettsMedicalSchool)基因突变与沉默技术——RNAidsRNA~22ntsiRNAstargetmRNAsecondarysiRNAsamplificationprocessing

degradationrecognitioncopying+processingspreading基因突变与沉默技术——RNAiC.elegansDrosophilaArabidopsisamplificationprocessingdegradat

ionrecognitioncopying+processingspreadingDICERDCR-1CAFAGO2RDE-1AGO1RISCSID-1RRF-1SDE-1/SGS-2RDE-4VIGCG1800Fmr1基因突变与沉默技术——RNAiC.elegansDrosophilaArabi

dopsisamplificationprocessingdegradationrecognitioncopying+processingspreadingDICERDCR-1CAFAGO2RDE-1AGO1RISCSID-

1RRF-1SDE-1/SGS-2RDE-4VIGCG1800Fmr1InitiationStepATPATPADP+ppiADP+ppiDICERKINASERdRPDicersiRNA5’3’5’3’RISCEffecto

rStep•siRNAbinding•siRNAunwinding•RISCactivation基因突变与沉默技术——RNAi研究案例IIIIIIIV1234567812345678910111213141516171

819201234567891011小英家系小英的心电图显性负效应基因突变与沉默技术——RNAi研究案例基因突变与沉默技术——RNAi研究案例基因突变与沉默技术——RNAi研究案例基因突变与沉默技术——RNAi研究案例HeartRhythm.2013

,10（1）：128–136基因突变、敲除与沉默技术——ZFNs技术锌指核酸酶是锌指蛋白和FokI核酸内切酶的剪切结构域组成的嵌合融合蛋白,其锌指蛋白结构域负责识别靶位点,依赖FokI的作用打断DNA双链,从而造成双链断裂，断开的双链DNA在修复过程中会发生碱基

的缺失、插入、同源交换等突变。基因突变、敲除与沉默技术——ZFNs技术锌指核酸酶：锌指蛋白Fokl+识别区域酶切区域◆靶点选择受限。◆“上下文效应”。◆Off-targeting现象严重。◆ZFNs的合

成组装技术难度大。基因突变、敲除与沉默技术——TALENs技术2009年，Boch等和Moscou等破解黄单胞菌效应子蛋白TALE（transcriptionactivator-likeeffector

s）与寄主靶基因DNA特异性识别分子密码。2011年SangamoBioSciences公司和哈佛大学的两个研究小组分别利用TALENs技术进行了基因组靶向修饰相关研究。基因突变、敲除与沉默技术——TALENs技术TALEnuclease结构DNA识别区（TALE蛋白）：TALE蛋

白是由植物病原体黄单胞菌属分泌的一种蛋白,能特异性的识别并结合DNA序列。剪切结构域（Fokl）：Fokl则可通过二聚化产生核酸内切酶活性,在该序列附近造成DNA的双链断裂(Double-standbreak,DSB)。基因突变、敲除与沉默技

术——TALENs技术TALE蛋白TALE蛋白是由12个或以上特异性识别DNA的串联“蛋白模块”和两侧的N-末端及C-末端序列组成。每个“蛋白模块”包含34个氨基酸，第12和13位残基是靶向识别的关键位点，被称作重复可变的双连氨基酸残基位点（Repeat

VariantDi-residue,RVD）。每个蛋白模块上RVDs对应识别一个碱基。基因突变、敲除与沉默技术——TALENs技术Fokl核酸内切酶TALENsZFNsFokl酶只有形成二聚体时才具有酶切活性，所以每次必须设计一对TALENs，在实际操作中需在目标基因中选择两处相邻（间隔1

7碱基）的靶序列（一般十几个碱基）分别进行TALE识别模块构建。TALENs和ZFNs使用相同的Fokl酶。基因突变、敲除与沉默技术——TALENs技术基因敲除步骤--TALE靶点识别模块构建Fourbasicsingle-unitvectors基因突变、敲

除与沉默技术——TALENs技术基因敲除步骤--TALE靶点识别模块构建基因突变、敲除与沉默技术——TALENs技术基因敲除步骤TALENs质粒对共转入细胞后，其表达的融合蛋白即可分别找到其DNA靶位点并与靶

位点特异结合。此时，两个TALENs融合蛋白中的FokI功能域形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，于两个靶位点之间打断目标基因。诱发DNA损伤修复机制，主要有非同源末端连接（NHEJ）和同源直接修复（HDR）。在

此修过程中形成一定的插入或缺失突变，即形成目标基因敲除突变体。基因突变、敲除与沉默技术——TALENs技术TALENs的优势TALE的核酸识别单元与A、G、C、T有恒定的对应关系。靶序列识别模块不受上下游影

响，特异识别并打断基因组中的任意靶序列。无基因序列、细胞、物种限制。毒性低、脱靶情况少。成对的TALE识别模块保证了基因敲除靶点的准确性。基因突变、敲除与沉默技术——TALENs技术TALENs的应用领域基因突变、敲除与沉默技术——CRISPR-Cas技术CRISPR-Cas：

由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术。基因突变、敲除与沉默技术——CRISPR-Cas技术CRISPR结构CRISPR：clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrep

eats是一个特殊的DNA重复序列家族,广泛分布于细菌和古细菌基因组中。CRISPR位点通常由短的高度保守的重复序列组成,重复序列的长度通常21～48bp,重复序列之间被26～72bp间隔序列隔开。CRISPR就是通过这些间隔序列与靶

基因进行识别。基因突变、敲除与沉默技术——CRISPR-Cas技术Cas家族Cas（CRISPRassociated）：存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在guideRNA引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。基

因突变、敲除与沉默技术——CRISPR-Cas技术CRISPR-Cas系统的细胞内免疫作用CRISPR-Cas系统赋予原核细胞针对外源DNA特异性免疫,而这种特异性是由间隔序列决定的。在宿主防御噬菌体攻击中，

针对自然界中庞大的噬菌体种群，细菌进化了CRISPR介导的适应性免疫。这种免疫功能的发挥是由CRISPR间隔序列的动态性变化，即通过增加或删除间隔序列来实现的。基因突变、敲除与沉默技术——CRISPR-Cas技术PAM（protospacer-adjacentmotif）为

NGG。在人类基因组中，平均每8bp就出现一个NGGPAM。基因突变、敲除与沉默技术——CRISPR-Cas技术PAM（protospacer-adjacentmotif）为NGG。基因突变、敲除与沉默技术——CRISPR-Cas技术CRISPR-Cas系统介导

基因修饰基因突变、敲除与沉默技术——CRISPR-Cas技术CRISPR-Cas系统介导基因修饰——dual-RNA基因突变、敲除与沉默技术——CRISPR-Cas技术CRISPR-Cas系统介导基因修饰——sg

-RNACas9sg-RNA基因突变、敲除与沉默技术——CRISPR-Cas技术CRISPR-Cas系统介导基因修饰——cr-RNA谢谢大家！