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临床基因诊断实验室技术准入的缺陷分析江苏省临床检验中心许斌我国医学实验室管理国家实验室认可委员会（CNAS）：依据-ISO15189；国家认可；自愿卫生部执业认证：《医疗机构临床实验室管理办法》为加强医疗机构临床实验室管理，提高临床检验水平，保证医疗质量和医疗安全，卫生部出台并决定自2006年6

月1日起施行。《办法》包括总则、医疗机构临床实验室管理的一般规定、质量管理、安全管理、监督管理、附则等六章五十六条。各省细则：《江苏省医院检验科建设管理规范》省、市临床检验中心，强制，【体系+能力】PCR实验室技术准入依据和标准《临床基因扩增检

验实验室管理暂行办法》卫医发[2002]10号《临床基因扩增检验实验室工作规范》卫检字[2002]8号《临床基因扩增检验实验室现场技术验收表》十章三十八款美国NCCLS对NAT的法规(一)1993年─1995年12月（MM3-A,已批准）NAT用于传染病的规定2000年（

MM1-A,已批准）NAT用于遗传病的规定2000年（MM5-P,审定中）NAT用于血液病的规定2001年（MM6-P,审定中）定量NAT用于传染病的规定2001年（MM7-P,审定中）原位杂交NAT用于遗传病的规定美国NCCLS对NAT的法规(二)2002年正在编写中的MM

9NAT用于遗传病的规定MM10遗传病的基因型鉴定MM11NAT用于细菌分裂MM12点阵式NAT在临检中的应用方法MM13NAT的样品制备MM14NAT的质控MM15NAT在“人类基因组”应用中的规定●物理的:分区及单向流动、专用移液器、一次性试管架、紫外灯、PCR工作罩、滤芯吸嘴。

●化学的：dUTP/UNGPCR产物防污染系统、DNA清洁液。●方法学的：即时Taqman法，Lab-on-a-chip芯片法，RTPCR一步法。●制度和操作规范（维护保养、执行）缺陷一、防污染意识和措施固定移

液器易耗品PCR方法学/防污染两步法RNAcDNAPCR一步法RNAPCRCT(I-Cycler/7000/COBAS-Taqman)Taqman动力学(CaliperAG-9900自动加样)Labo

naChip封闭废液孔RTTaqTth(RT+Taq)扩增中以脱氧尿苷(dUTP)取代脱氧胸苷(dTTP)，扩增产物可被尿苷酶(UNG)消解，在经加热处理，即在脱氧尿苷处断裂，不再能作为模板被扩增。后续扩增进行之前在PCR反应体系中加入UNG处理

，在预变性加热后，可能的产物污染即被消除。PCR防污染UNG和dUTP防止“假阳性”的图解这种“假阳性”是由于污染了前次PCR产物所致TAAAATTTTAAAAUUUPCRAAATUTAAAUUUAAAAAA*UNG加热PCRUNG/dUTP系统实验室分区原则单一流向、明确的识别

标记各区仪器设备物品配备的充分性和科学性防污染分区南通医学院附属医院临床基因诊断实验室布局及人流、物流平面示意图产物分析区PCR扩增区样品准备区试剂准备区样品接收区工作走向门门门门门单口洗眼器900传递窗20001

77010502800洗涤室急诊室生化室临检室2500300026005009009009005000500050002496标本处理电脑输出PCR1缓冲PCR2缓冲缓冲PCR3PCR4缓冲3000490017006100500ABBBBBB

BBA2550450015007506000750冰库库房杂物间二楼实验项目说明编号名称规格（W*D*A中央水柜1500*75B边台1500*750*8C边台2600*500*8D采血台6100*500*E采血台10000*500F接样台5850*5

00*G边台5800*750*8H电脑台2550*750*I电脑台4500*750*J边台3000*750*8K边台4900*750*8L边台2900*750*8M边台2800*750*8N边台2100*750*8O边台3800*750*8P标本柜900*500*2Q边台5100*750

*8R器皿柜900*500*2S手推车800*450*8T紧急淋浴器**传递窗685*590*900标本室空调机房微生物室微生物室5100缺陷二、档案管理仪器档案（a）制造商名称、型号、序号或其它唯一性标识；（b）仪器使用说明书或其复印件；（c）校准/检测的日期和结果以及下次校准

和/或检测的日期；（d）迄今所进行的维护和今后维护计划的细节；（e）损坏、故障、改装或修理的历史。人员档案实验室应保存其技术人员有关资格证书（如上岗证）、培训、技能和经历等技术档案。缺陷三、记录内容形式保存缺陷四、质量控制SOP文件的现行有效性仪器的标志及维护保

养试剂及耗品的质检PCR检测流程标本采集核酸提取基因扩增产物检测•采集的方法•核酸的稳定性•保存•分离方法*•效率•保存•效率•检测方法*•测定的线性*DNA、RNA的浓度和纯度测定及保存此法准确、快速，且不损坏样品。可测出浓度低于2.5ug/ml的核酸。测定时将样

品作适度的稀释。用紫外分光光度仪检测，记录280nm和260nm处的吸光度。280nm为蛋白吸收峰，260nm为核酸吸收峰。其中260nm处读数用来计算样品的核酸浓度。1、紫外分光光度法10D/A260nm=50ug/ml双链DNA10D/A260nm=33ug/ml单链DNA10

D/A260nm=40ug/mlRNADNA总产量（ug）=OD(A260nm)×50ug×稀释倍数×样品总体积DNA浓度（ug/ml）=OD值(A260nm)×50×稀释倍数提取RNA总产量（ug）=OD值(A260nm)

×40ug×稀释倍数×样品总体积RNA浓度（ug/ml）=OD值(A260nm)×40×稀释倍数2、琼脂糖凝胶微型电泳法未知浓度的微量DNA片段可与已知浓度的DNA同时电泳，根据其结合的溴乙锭荧光强度其含量。电泳时各DNA的体积要准，否则会有误差。3、纯度检查天然DNA的吸

光度比值为A260nm：A230nm：A280nm=1.0:0.450:0.515纯DNA液的A260:A280:应为1.8-1.9。如比值低于1.6时，这提示有蛋白质和酚的污染，应进一步纯化。4、RNA完整性检查常用

变性的琼脂糖电泳法检查，常用的变性剂为甲醛、乙二醛和羟甲基汞。完整的RNA经变性电泳后能分离出核糖体RNA中的28S和18S，且EB的显色强度应为2:1左右。如28S带降低而18S带增加则表示RNA标本有所降解。5、DNA、RNA的保存4℃是DNA保存的最佳和最简单

的条件之一。-70℃可能是长期保存的良好温度。但解冻时DNA可产生缺口，因此不宜反复冻融。DNA在TE缓冲液中（10mmol/LTris-Hcl，1mmol/LEDTA，PH8.0），4℃储存6个月以上，其中EDT

A还可抑制微生物生长。RNA容易降解，操作和储存中要防止RNA酶的污染。所用器皿高压灭菌后用，重蒸水配制或用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的蒸馏水溶解RNA，RNA溶液中加入RNA酶抑制剂（RNasin），终浓度为2U/10μl，置-20℃保存备用。血清标志物用于疾病诊断、流行病调查基因

检测用于疗效监控、预后判断样品筛查检测筛查试剂阳性反应阴性反应重复检测原有试剂加另外一种筛查试剂一阴一阳均阴性反应均阳性反应送确认实验室进行确认阴性报告HIV抗体筛查试验流程图英国HBV血清学诊断的SOP(V.SOP6)HBsAgAssayNegativeReaciv

eReport:HBsAgNegativeConfirmatoryHBsAgtestfromclotaccoringtoassayandlocalprotcal(egneutralisationorsecondHBsAg)NegativeReactiveV.SOP7Repeat1sta

ssayfromclot(ifavailble)BothtestsNegative1streactive2ndnegativeAnti-HBctestReportHBsAgnegativeAnti-HBcNegativeAnti-HBcReactiveR

eport:HBsAgequivocalRequestfurthsampleReport:Anti-HBcReactive.FurthertestAnti-HBbcIgM,HBeAg/anti-HBeandreq

uestafurthersample实验室检测抗-HCV程序抗-HCVEIA阴性报告RR阳性S/CO比值<3.8抗-HCVRIBAHCVRNANAT阴性其他结果评价(如NAT、ALT)阴性阳性可疑阳性RR阳性S/CO>3.8或报告报告报告报告报告我们如何选择合适的替代终点以合理考评疗效

?HBsAg消失-完全应答HBVDNA清除或抑制-病毒学应答‘e’血清转化（HBeAg消失+抗HBe产生）-病毒学应答ALT恢复正常-生化应答肝脏组织学表现-组织学应答还是联合应答？HBVDNA清除或抑制？➢优点:HBVDNA抑制表示HBV复制的抑制水平

，与HBeAg消失和/或ALT恢复正常相关。➢缺点:◼不可能完全清除,不能反映持续应答◼抑制程度:105(AASLDguideline)还是104(AGAPanelrecommendation*)?◼检测没有国际单位:无法采用标准化单位报告结果（copie

s/mL、pg/mL、meq/mL、logdrop）◼敏感性不同阻碍了对治疗效果的比较*PhairJNATURALHISTORY,DIAGNOSTICS,ANDCLINICALPROFILESOFPERSONSWITHCHRONICHEPATITISB核酸检测要点灵敏

度，<50copy/ml特异性分型突变定量的一致性疗效观察、验证诊断定量PCR技术标准品（Panel）•SDA:参照WHOHBVStandard英国NIBSC(97/746)Adw106IU/ml等于2.65×10

6拷贝/毫升PanelNo:L0L1L2L3L4L5•CNCCL:HBVDNA1PanelNo:1，2，3，4，5•国家标准局基质问题：基质(Matrix)真实血样：样品纯度和抑制剂PCR定量方法的比较实时法Taqman终点法Taqman终点酶标或芯片法外标法7000,96

孔,四波长I-cycler,96孔,四波长Light-cycler,32孔,三波长cutoff值104/ml用于定量的必要条件：1.样品纯度高2.CT值必须小于353.定量试剂的生产文号内标法COBAS-Taqm

an,4×24孔，四波长cutoff值50/ml用于定量的必要条件：1.终点循环数必须小于352.定量试剂的生产文号FX-990，FS-1000，FT-2000，DA620等cutoff值105/ml用于定量的必要件：1.样品纯度高2.终点循环数必须小于353.

定量试剂的生产文号酶标仪，96孔，手动检测Caliper1000,12孔,自动检测CaliperAMS-90SE,96孔,自动加样，自动检测COBAS-Amplicor，24孔,自动扩增，自动检测cutoff值102/ml用于定量必要

条件：1.终点循环数必须小于352.定量试剂的生产文号技术要素5.3(14条)-检测仪器覆盖分析所有过程的品种、数量满足要求可控状态：标志、档案、状态、使用安全5.3.2设备（在安装时及常规使用中）应显示出能够达到规定的性能标准，并且符合

相关检验所要求的规格。实验室管理层应建立程序，用于定期监测并证实设备、试剂及分析系统已适当校准并处于正常功能状态。同时还应有文件化的预防维护程序并记录，该程序至少应遵循制造商的建议。性能、状态评价—校验或检定（物理参数）❖VERIFICATION-验证、

证明、检验、证据—翻译为校验更准确！查明和确认计量器具是否符合法定要求的活动，他包括检查、加标志和（或）出具检定证书。❖校准-CALIBRATION（校准、标定、标准化、测量的尺度）在规定的条件下，为确定测量仪器（测量系统）所指示的值，与对应的由测量标准所复现的值之间关系的一组操作。校验

周期与内容频度：首次（新安装）；后续（主要部件维修，强制周期如每年，不定期）内容：❖血细胞分析仪：背景计数、精密度及携带污染在说明书规定的范围内（如仪器无规定，精密度应小于室间质评允许范围的1/4，携带污染小于2%）❖全自动生化分析仪：加样准确度、携带

污染率，温控，吸光度零点漂移、杂闪光、准确度、重复性、线性等仪器说明书标示的指标在规定范围内❖PCR仪：温度准确度及升降速率；荧光本地；激发及吸收波长的准确度、杂闪光、重复性、线性需要校验的仪器设备温湿度计：环境、冰箱、冷库等加样设备：移液器、血沉管等制水机分析仪器

检测仪器状态维持—维护保养❖保养程序、操作手册严格按照仪器使用手册编写，包括日、周、月、季、半年、年❖标识（时间、名称）❖记录（检）测室内质控的SOP：耗品质检试剂质检质控方法（纠错措施）质控图室间质评的SOP：纠偏措施室内质控质控目的：假阴性、假阳性，准确性、精密度质

控点：样本质量、模板提取、扩增效率质控物安排：空白、阴对、弱阳对、标准品控制范围：空白、阴对-------阴性弱阳对-------阳性（上下一次方）标准品-------r值（二个9）斜率（-3.5----4.0）截距（-40左右）点间CT值（3.3左右）如何确定CT值阈值

（Threshold）的作用阈值CT阈值高度标准偏差阈值=基线信号的标准偏差×10如何确定阈值基线的作用（Baselinecycles）消除检测中背景荧光信号的影响，确定阈值基线的范围：仪器一般默认的范围PE-5700、PE-70003-15iCycle2-10LightCycle3-12基线需

根据实验结果进行适当调整：延长基线以包括最高浓度样本扩增曲线起跳前尽可能多的循环，可以使扩增曲线更平滑、数据也得到一定改善。阈值线荧光阈值线的调整需根据实验结果进行适当调整1、落在阴性对照线最高点上方2、外标准扩增

曲线的均一位置（点间CT3.3左右）3、尽量接近扩增曲线刚真正进入指数扩增期的位置（避免弱阳性漏检以及一些扩增反应影响因素在指数期的放大）9.522E+91.024E+99.433E+71.127E+71.029E+69.902E+41.021E+49.217E

+29.276E+11.085E+1H2O1.0E+101.0E+91.0E+81.0E+71.0E+61.0E+51.0E+41.0E+31.0E+21.0E+1H2OThresholdCycleCalculation:BaselinecyclesThroughThresholdPos

ition21420.8标准曲线通过基线和荧光域值线的调整应达到：相关系数（r值）≥0.99斜率-3.0----4.0截距-40±4（这些参数根据仪器和试剂有所不同）室内质控由实验室工作人员采用一系列统计学的方法连续地评价检测工作的可靠程度，判断检验报告是否可以发出的过程。

目的是控制本实验室测定工作的精密度，监测其准确度的改变，提高常规检验工作的批间、批内标本检测结果的一致性。质控血清人血清基质，分布均匀；无传染性；添加剂和调制物的数量少；瓶间变异小；冻干品其复溶后稳定；到实验室后的有效期应在1年以上

液体血清较优不用定值血清，而推荐用价廉的未定值血清在开始进行质控时，只需要有3个质控血清测定值即可进行质控。当这组数据扩大到20次有效值时就可以计算RCV的X，s。方法：（1）先将测定值从小到大排列，X1最小，Xn最大；（2）计算X和s；（3）计算SI上限值和下限值

。SI上=（X最小-X）/S，SI下=（X最大-X）/S对照SI表，检查是否出控，SI上、下限≤规定值，在控；SI上或下限>规定值，失控。“即刻性”质控：SI值表（即刻性质控）N34567891011N(3s)1

.151.491.751.942.102.222.322.412.48N(2s)1.151.461.671.821.942.032.112.182.231213141516171819202.552.612.662.712.752.792.822.852.882.292.3

32.372.412.442.472.502.532.56常用的质控规则12s；一个质控结果超过X±2S，此为警告规则；12.5s；一个质控结果超过X±2.5S，提示存在随机误差；13s；一个质控结果超过X±3S，提示

存在随机误差；R4s；同批两个结果之差超过4S，即一个质控结果超过X+2S，另一个结果超X-2S。提示存在随机误差；22s；两个连续质控结果同时超过X+2S或X-2S，提示存在系统误差；41s；一个质控品连续的四次测定结果都超过X+1

S或X-1S，两个质控品连续两次测定都超过X+1S或X-1S，提示存在系统误差；7T；七个连续的质控结果呈现出向上或向下的趋势，提示存在系统误差；10x；十个连续的质控结果在平均数的一侧，提示存在系统误差。失控情况处理及原因分析填写失

控报告单上报实验室负责人，由负责人作出是否发报告的决定分析失控原因重做同一质控物（人为差错、偶然误差）↓新开一瓶质控物（质控物使用、保管）↓新开另一批号质控物（质控物使用、保管）↓重新校准（校准错误）↓进行仪器维护，更换试剂（仪器、试剂）↓请专家帮助完成失控报告

单质量审核型式检查（编号唯一性、项目完整性、书写完整性）仪器检查（状态、校准）试剂检查（效期）质控检查（室内、室间）异常值检查（及时与临床联系）