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生物化学蛋白质的共价结构医学知识一、蛋白质通论蛋白质的化学组成碳50%氢7%氧23%氮16%硫0～3%其它（P、Fe、Cu、I、Zn、Mo、Mn、Ca等）生物化学蛋白质的共价结构医学知识2定氮法测定蛋白质含量氮为蛋白质的

特征元素，将提取并纯化的蛋白质用凯氏定氮法测定氮的含量，然后通过下列公式可以计算蛋白质的含量：蛋白质含量（mg/ml）=蛋白氮（mg/ml）×6.25（或=蛋白氮（mg/ml）÷16%）生物化学蛋白质的共价结构

医学知识3蛋白质的分类Ⅰ仅由氨基酸缩合而成，不含其它成分的蛋白质叫单纯蛋白质（simpleprotein）；还含有其它成分的蛋白质叫缀合蛋白质（conjugatedprotein），缀合蛋白质中的非蛋白质成分叫配体（ligand），有些配体与蛋白质通过共价键结合，有些通过非共价键结合。生物化

学蛋白质的共价结构医学知识4蛋白质的分类Ⅱ蛋白质还可以：按溶解性质分类（见P158表4-1）按所含配体种类分类（见P158表4-2）按生物学功能分类（见P158表4-3）生物化学蛋白质的共价结构医学知识5蛋白质的形状纤维状

蛋白质球状蛋白质膜结合蛋白质CollagenMyoglobinBacteriorhodopsin生物化学蛋白质的共价结构医学知识6蛋白质的大小Ⅰ蛋白质Mr残基数目/链亚基组织方式细胞色素c（马）1250

0104α1己糖激酶（酵母）96000200α4胰岛素573321（A）30（B）αβ血红蛋白（人）64500141（α）146（β）α2β2糜蛋白酶（牛胰）2260013（α）132（β）97（γ）αβγ

生物化学蛋白质的共价结构医学知识7蛋白质的大小Ⅱ蛋白质的分子量很大，并且分布范围也很大，一般在大约6000～1×106道尔顿。蛋白质的分子量主要由组成蛋白质的氨基酸残基的数目决定，对于缀合蛋白质来说，有些配体也在蛋白质的分子量中占有很

大的比重。蛋白质的分子量范围是人为规定的，更小的氨基酸缩合物叫做肽。生物化学蛋白质的共价结构医学知识8蛋白质氨基酸残基数的估计对于简单蛋白质，用110除它的相对分子量即可约略估计出其氨基酸残基数目。20种常见氨基酸的

平均分子量为138组成蛋白质的氨基酸的平均分子量为128每个氨基酸残基的平均分子量为110生物化学蛋白质的共价结构医学知识9蛋白质结构的组织层次➢一级结构指的是多肽链的氨基酸序列➢二级结构指的是多肽链借助于氢键排列成有规律的、局部的结构➢三级结构是指多肽链借助各种非共价键弯曲、折

叠成具有特定走向的紧密球状构象➢四级结构指的是寡聚蛋白质亚基间的结合，亚基间不同的排列方式会形成不同的构象。生物化学蛋白质的共价结构医学知识10Lys-Cys-Phe-Ala-Ile-Glu-Cys-Leu｜｜———————蛋白质的一级结构S—SN端C端生物化学蛋白质的共价结构医学知识11蛋白质

的二级结构“Shorthand”α-helix“Shorthand”β-td生物化学蛋白质的共价结构医学知识12蛋白质的三级结构Chymotrypsinspace-fillingmodelChymotrypsinribbon生物化学蛋白质的共价结构医学知识1

3蛋白质的四级结构生物化学蛋白质的共价结构医学知识14蛋白质的一级结构决定高级结构在肽链内或肽链间有时也有两个半胱氨酸之间形成二硫键的连接。生物化学蛋白质的共价结构医学知识15蛋白质功能的多样性1．催化；2．调节；3．转运；4．贮存；5．运动；6．结构成分；7．支架作用；8．防御和进攻；9．异常

功能。生物化学蛋白质的共价结构医学知识16二、肽肽的命名Ⅰ肽是两个至数百个氨基酸之间由肽键连接而成的线状聚合物。根据形成肽的氨基酸数目，一般氨基酸数目在12个以内时，称为二肽、三肽、四肽等；13个至20个时称为寡肽（oligopeptide）；20个以上称为多肽（polypeptid

e）。当分子量大到一定程度时，就称为蛋白质。寡肽和多肽的区分完全是人为规定的，其间的界限并不严格。肽链中的氨基酸因缺少了一分子水，叫做氨基酸残基。生物化学蛋白质的共价结构医学知识17肽的两端一条肽链是有方向性的，肽链的一端具有游离的α－氨基，称其为N端；另一端具有游离的α－羧基

，称其为C端。有少数小分子量的肽，其首尾也缩合成肽键，成为环肽。生物化学蛋白质的共价结构医学知识18肽的命名Ⅱ对于小分子量的肽的命名，是从其N端开始，称为某氨酰某氨酰某氨酰……某氨基酸，下例写成Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu，左边是N端，右边是C端。生物

化学蛋白质的共价结构医学知识19肽的命名Ⅲ对于生物体内的具有特定结构和功能的小分子量肽，还有特别名称，如脑啡肽、内啡肽、催产素、加压素等。生物化学蛋白质的共价结构医学知识20肽基的C、O和N原子间的共振相互作用生物化学蛋白

质的共价结构医学知识21肽键共振的结果Ⅰ①限制肽键的自由旋转，给肽主链的每一个氨基酸残基只保留两个自由度。②组成肽基的4个原子和2个相邻的Cα原子倾向于共平面，形成所谓的多肽主链的酰胺平面（amideplane）或称肽平面（pep

tideplane）。肽平面生物化学蛋白质的共价结构医学知识22肽键共振的结果Ⅱ③C－N键的长度为0.133nm，比正常的C－N单键（0.145nm）短，但比典型的C=N键（0.125nm）长。估计肽基中的C－N键具

有约40%的双键性质，而C=O键具有40%的单键性质，在室温下足以防止C－N键旋转。④杂化的中间态酰胺带有0.28个净正电荷，羰基带有0.28个净负电荷，肽键具有永久偶极。生物化学蛋白质的共价结构医学知识23肽基

的顺、反构型肽平面内，两个Cα可以处于顺式或反式构型。因为顺式构型两个R基有空间位阻，所以反式构型比顺式构型稳定，因此肽链中肽键几乎都是反式构型。生物化学蛋白质的共价结构医学知识24脯氨酸的亚氨基形成的肽键Ofthepeptidebondsbetweenaminoacidres

iduesotherthanPro,over99.95%areinthetransconfiguration.Forpeptidebondsinvolvingtheiminonitrogenofproline,however,about6%areinthecisco

nfiguration;manyoftheseoccuratturns.transcis生物化学蛋白质的共价结构医学知识25肽的物理化学性质Ⅰ➢由于短肽晶体的熔点都很高，说明短肽的晶体是离子晶格，在水溶液中以偶极离子存在。➢在pH0～14范围内，肽键中的酰胺氢不解离

，所以肽的酸碱性主要决定于肽链末端的α－羧基、α－氨基以及R基团上的可解离基团。➢因为肽链末端的α－羧基和α－氨基相距很远，它们之间的静电引力较弱，所以它们的酸碱性比氨基酸的α－羧基和α－氨基弱。R基上可解离基团的解离常数也有所变化。➢在某一pH下，肽中各可解离基团解离得到的净

电荷为0，这个pH就是该肽的等电点。生物化学蛋白质的共价结构医学知识26肽的物理化学性质Ⅱ➢肽的化学反应和氨基酸的一致。N端的氨基酸残基也可以与茚三酮反应，这一反应可用于肽的定性和定量测定。➢双缩脲反应是肽和蛋白质特有的，氨基酸没有此反应

。一般含有两个或两个以上肽键的化合物与CuSO4碱性溶液都能发生双缩脲反应，生成紫红色或蓝紫色的络合物，利用这个反应可以用分光光度法（540nm）测定蛋白质的含量。生物化学蛋白质的共价结构医学知识27双缩脲反应形成的络合物生物化

学蛋白质的共价结构医学知识28双缩脲与肽的结构比较双缩脲三肽生物化学蛋白质的共价结构医学知识29三、蛋白质一级结构的测定蛋白质测序的策略Ⅰ➢首先要得到较纯的蛋白质样品，纯度应在97%以上。➢测出它的分子量。➢分析蛋

白质中是否有非肽成分。➢测定蛋白质分子中的多肽链的数目。➢拆分多肽链。➢测定肽链的氨基酸组成。➢鉴定肽链的C末端氨基酸及N末端氨基酸。生物化学蛋白质的共价结构医学知识30蛋白质测序的策略Ⅱ➢酶水解肽链成短的肽段。采用两套以上的酶水解方法，得到互相重叠的肽段。分离纯化这些肽段，并鉴定各肽段的C末

端氨基酸及N末端氨基酸。➢测定各肽段的序列。➢确定天冬酰胺、谷氨酰胺以及链内或链间二硫键的位置。➢拼出完整肽链的序列。生物化学蛋白质的共价结构医学知识31N末端分析Ⅰ➢二硝基氟苯法（DNFB法）：用DNFB（Sanger试剂）与肽链N末端

的氨基反应，生成DNP－多肽或DNP－蛋白质。然后水解肽链，分离得到DNP－氨基酸，纸层析、薄层层析或HPLC分离鉴定。➢丹磺酰氯法（DNS法）：与DNFB法类似，由于丹磺酰氯有强烈荧光，灵敏度比DNFB法高100倍。DN

P-氨基酸生物化学蛋白质的共价结构医学知识32N末端分析Ⅱ➢苯异硫氰酸酯法（Edman降解法）：肽链与PITC（Edman试剂）反应生成PTC－多肽（苯氨基硫甲酰多肽）或PTC－蛋白质，在酸性有机溶剂中加热时，N末端的PTC－氨基酸发生环化，生成苯乙内酰硫脲的衍生物（PTH－氨基酸）并从肽

链上脱落下来，除去N末端氨基酸后剩下的肽链仍然是完整的。分离PTH－氨基酸并鉴定。肽链可用于鉴定下一个氨基酸，所以此法可以用于测序。➢氨肽酶法：根据游离氨基酸出现的时间顺序分析N末端氨基酸。值得注意是不同的N末端氨基酸水解的速度不同，有时难以分析。PTH-氨基酸生物化学蛋白

质的共价结构医学知识33C末端分析Ⅰ➢肼解法：蛋白质或多肽与无水肼加热发生肼解。反应中除C末端氨基酸以游离形式存在外，其它氨基酸都转变成相应的氨基酸酰肼。反应中生成的氨基酸酰肼可与苯甲醛作用变成水不溶性的二苯基衍生物而沉淀。上清液中游离的C末端氨基酸借助DNFB法或DNS法鉴定。

肼解过程中，天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸被破坏不易测出，精氨酸转变成鸟氨酸。生物化学蛋白质的共价结构医学知识34肼解法反应式生物化学蛋白质的共价结构医学知识35C末端分析Ⅱ➢还原法：肽链C末端的氨基酸可用硼

氢化锂还原成相应的α－氨基醇，肽链水解后层析鉴定。生物化学蛋白质的共价结构医学知识36C末端分析Ⅲ➢羧肽酶法：目前常用的有4种羧肽酶：A、B、C和Y。羧肽酶A能释放除Pro、Arg和Lys之外的任何一种C末端氨基酸；羧肽酶B只能水解以碱性氨基酸Arg和Lys为C末端的氨基酸；羧肽

酶C和Y可以释放任何一种C末端氨基酸。-Val-Ser-Gly……生物化学蛋白质的共价结构医学知识37二硫桥的断裂先加8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍使蛋白质变性，再用氧化法或还原法断裂二硫键。还原法产生的巯基要用烷基化试剂如碘乙酸保护起来，以免

重新形成二硫键。生物化学蛋白质的共价结构医学知识38还原法断裂二硫桥巯基保护反应生物化学蛋白质的共价结构医学知识39氧化法断裂二硫桥过甲酸生物化学蛋白质的共价结构医学知识40氨基酸组成的分析➢酸水解分析除色氨酸外的其它氨基酸，碱水解分析色氨酸。➢为了准确分

析酸水解中被部分破坏的Ser、Thr、Tyr、Cys的量，酸水解24、48、72小时后，分析这些氨基酸的量，然后外推至0时得到这些氨基酸不被破坏时的量。➢分析酸水解液中NH3的量，得出有多少个Asn+Gln。➢氨基酸的分析：离子

交换柱层析分离，茚三酮染色，比色定量。生物化学蛋白质的共价结构医学知识41某些氨基酸含量随水解时间的变化易被破坏的氨基酸采用外推法测定疏水氨基酸难以水解，采用极限法测定生物化学蛋白质的共价结构医学知识42氨基酸分析仪示意图加热生物化学蛋白质的共价结构

医学知识43氨基酸分析仪示意图长柱用于分离酸性和中性氨基酸短柱用于分离碱性氨基酸和氨柱中填料为细粒聚苯乙烯磺酸型阳离子交换树脂生物化学蛋白质的共价结构医学知识44氨基酸的离子交换柱层析图谱洗脱曲线生物化学蛋白质的共价结构医学知识45多肽链的部分裂解➢酶裂解法：胰蛋白酶、胰凝乳

蛋白酶（糜蛋白酶）、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、葡萄球菌蛋白酶、梭菌蛋白酶等，它们各自有自己的水解专一性。蛋白酶分为内肽酶和外肽酶（羧肽酶、氨肽酶）。➢化学裂解法：溴化氰（只裂解由Met的羧基形成的肽键）、羟胺（裂解Asn-Gly之间的肽键，也能部分裂解Asn-Leu及Asn

-Ala之间的肽键）。生物化学蛋白质的共价结构医学知识46蛋白酶的专一性AECys生物化学蛋白质的共价结构医学知识47溴化氰裂解法溴化氰只裂解由Met的羧基形成的肽键生物化学蛋白质的共价结构医学知识48肽段的分离纯化凝胶过滤凝胶电泳高效液相色

谱生物化学蛋白质的共价结构医学知识49氨基酸序列测定Ⅰ➢质谱法：两台质谱仪联用，第一台质谱仪通过电喷射电离使肽段带上电荷，将不同大小的肽段分离。第二台质谱仪分析肽段的序列。在第二台质谱仪上，小肽段在碰撞池中与氮气分子或氩气分子碰撞，碎裂成依次少一个氨基酸残基的碎片，分析这些碎片的质量

差，可得出序列。生物化学蛋白质的共价结构医学知识50串联质谱仪生物化学蛋白质的共价结构医学知识51串联质谱测序工作原理分离肽段测序生物化学蛋白质的共价结构医学知识52氨基酸序列测定Ⅱ➢Edman降解法：由N端向C端逐步

降解。先将被测肽段的羧基端固定到不溶性的树脂上，便于分离切下的氨基酸和剩余的肽段。➢酶降解法：用外肽酶逐个切下氨基酸分析。只能分析很少的几个氨基酸。➢根据核苷酸序列的推定法：找到该蛋白质的基因，从基因的编码序列按三联密码推出氨基酸序列。生物化学蛋白质的共价结构医学知识53所得资料：

N-末端残基HC-末端残基S第一套肽段第二套肽段OUSSEOPSWTOUEOVEVERLRLAAPSHOWTHO借助重叠肽确定肽段次序：末端残基HS末端肽段HOWTAPS第一套肽段HOWTOUSEOVERLAPS第二套肽段HOWTOUSEO

VERLAPS推断全序列HOWTOUSEOVERLAPS肽段在多肽链中次序的决定生物化学蛋白质的共价结构医学知识54二硫桥位置的确定Ⅰ在保留二硫桥的情况下对蛋白质部分水解，利用对角线电泳可以鉴定出哪些肽段带有二硫桥。对角线电泳是双

向电泳，把水解后的肽段混合物点到滤纸的中央，第一向将肽段按大小和带电荷情况分离，然后把滤纸暴露到过甲酸蒸气中，使二硫桥断裂，再在同样的条件下进行第二向电泳。生物化学蛋白质的共价结构医学知识55对角线电泳生物化学蛋白质的共价结构医学知识56对角线电泳生物化学蛋白质的共价结构医学知识57二硫桥位置的确

定Ⅱ二硫桥连接的两个肽段在第一向时是一个斑点，第二向时成了两个斑点，并离开对角线。对这两个斑点相对应的肽段进行测序，如果两个肽段中各只有一个Cys，它们就是参与二硫桥的Cys。根据这两个肽段的序列，可知它们在整个肽链中的位置。生物化学蛋白质的

共价结构医学知识58酰胺位置的确定对肽链进行各种部分水解，直到测得一个肽段中只有1个天冬酰胺或谷氨酰胺为止。生物化学蛋白质的共价结构医学知识59四、蛋白质的氨基酸序列与生物功能有些来源于不同生物的蛋白质的氨基酸序列具有明显的相似性，这种序列上的相似性叫做同源性。同源蛋白质中

有许多氨基酸残基是相同的，称为不变残基，或保守性残基，而在不同物种的同源蛋白质中不同的氨基酸残基称为可变残基。亲缘关系越近的同源蛋白质的同源性越强。同源蛋白质往往在不同生物体中行使相同或相似的功能，例如各种脊椎动物体内的血红蛋白就属于同源蛋白质。生物化学蛋白质的共价结构医学知识6

0细胞色素C细胞色素C是一种含血红素的蛋白质，在线粒体中起电子传递的作用。大多数细胞色素C含一百零几个氨基酸残基，40多个物种的细胞色素C氨基酸序列分析表明，有28个残基是不变的，所有细胞色素C在第17位上都是一

个Cys残基，这个残基是血红素结合的部位。生物化学蛋白质的共价结构医学知识61细胞色素C的不变残基此区域可能是与酶结合的区域生物化学蛋白质的共价结构医学知识62不同物种细胞色素C的差异残基数黑猩猩绵羊响尾蛇鲤鱼蜗牛天

蛾酵母花椰菜欧防风人01014182931444443黑猩猩1014182931444443绵羊20112427444646响尾蛇262833474543鲤鱼2626444746蜗牛28485150天蛾444441

酵母4747花椰菜13生物化学蛋白质的共价结构医学知识63根据细胞色素C建立的系统树哺乳类鸟和爬虫类硬骨鱼类软骨鱼类真菌昆虫两栖类植物生物化学蛋白质的共价结构医学知识64氧合血红素蛋白质肌肉中的氧合血

红素蛋白质——肌红蛋白（Myoglobin）由一条肽链组成，含153个氨基酸残基，红细胞中的血红蛋白（Hemoglobin）是一个由两条α链（每条链141个氨基酸残基）和两条β链（每条链146个氨基酸残基）组成的四聚体蛋白

。肌红蛋白、血红蛋白的α链和β链都是珠蛋白（globin），它们有很高的序列同源性，通过血红素结合氧的能力都被这3种多肽链保留下来了。生物化学蛋白质的共价结构医学知识65氧合血红素蛋白的进化树生物化学蛋白质的共价结

构医学知识66丝氨酸蛋白酶类胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、凝血酶以及纤溶酶都是丝氨酸蛋白酶，它们有足够的序列同源性，在它们的活性中心都有丝氨酸，说明它们可能是由祖先丝氨酸蛋白酶进化而来。生物化学蛋白质的共价结构医学知识67五、肽和蛋白质的人工合成肽的人工合成最广泛应用的氨基

保护基是苄氧甲酰基，它可以用催化加氢或用金属钠在液氨中处理去除。其它可以用作氨基保护基的还有三苯甲基、叔丁氧甲酰基、对甲苯磺酰基等，这些基团可以用HBr/CH3COOH在室温下除去。（氨基的保护）生物化学蛋白质的共价结构医学知识69肽的人工合成（羧基的保

护）羧基一般用盐或酯的形式保护。盐是对羧基临时性的保护。酯有甲酯、乙酯、苄酯和叔丁酯等。甲酯和乙酯可用皂化法除去，但易引起消旋。苄酯可用H2/Pd法或金属钠－液氨法除去。叔丁酯可在温和条件下用酸除去。生物化学

蛋白质的共价结构医学知识70肽的人工合成（侧链上活泼基团的保护）侧链上需要保护的活泼基团有：Asp和Glu的β和γ羧基，Ser、Thr和Tyr的羟基，Cys的巯基，Lys的ε氨基，Arg的胍基等。这些保护基团有苄基、对甲苯磺酰基、甲基等。生

物化学蛋白质的共价结构医学知识71各种保护基团生物化学蛋白质的共价结构医学知识72现在最常用的氨基保护基团Fmoc(9-fluorenyl-methoxycarbonyl)-9-芴甲氧羰基生物化学蛋白质的共价结构医学知

识73羧基的叠氮法活化生物化学蛋白质的共价结构医学知识74羧基的活化酯法活化生物化学蛋白质的共价结构医学知识75羧基的混合酸酐法活化氯甲酸乙酯叔胺生物化学蛋白质的共价结构医学知识76碳二亚胺缩合剂生物化学蛋白质

的共价结构医学知识77缩合剂催化的肽键形成生物化学蛋白质的共价结构医学知识78固相肽合成将待合成肽链C端的第一个氨基酸的羧基连接到氯甲基聚苯乙烯树脂上，然后向N端方向依次将后续的氨基酸缩合上去。此法便于自动化操

作。生物化学蛋白质的共价结构医学知识79固相肽合成图Ⅰ生物化学蛋白质的共价结构医学知识80固相肽合成图Ⅱ生物化学蛋白质的共价结构医学知识81分步合成的效率对最终产量的影响生物化学蛋白质的共价结构医学知识82