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DNA测序技术的原理发展和在医学中的应用DNA测序技术DNA是一种长链聚合物，组成单位为四种脱氧核苷酸(dATPdTTPdCTPdGTP)。这些碱基沿着DNA长链所排列而成的序列，可组成遗传密码，指导蛋白质的合成。测序分析能够为基因DNA序列提供最真实可靠的信息，它可

以比较全面地描述基因的复杂性和多样性。2DNA测序技术的原理发展和在医学中的应用DNA测序技术ü测定未知序列ü研究基因组多样性ü确定重组DNA的方向与结构ü对突变进行定位和鉴定3DNA测序技术的原理发展和在医学中的应用DNA测序的发展历程经典DNA测序技

术Ø70年代末，Maxam和Gilbert发明化学法、Sanger发明双脱氧终止法手动测序（同位素标记）Ø80年代中期，出现自动测序仪（应用Sanger双脱氧终止法原理）、荧光代替同位素，采用计算机图

象识别Ø90年代中期，测序仪重大改进、集束化的毛细管电泳代替凝胶电泳Ø2001年完成人类基因组框架图，全部采用基于Sanger双脱氧原理的自动化毛细管测序。4DNA测序技术的原理发展和在医学中的应用DNA测序

的发展历程5DNA测序技术的原理发展和在医学中的应用DNA测序的发展历程第二代测序技术6DNA测序技术的原理发展和在医学中的应用DNA测序的发展历程454的特点与主要应用Ø读长较长，400－600bpØ通量较低，400－600M

bØ相对成本较高Ø主要应用：denovo测序7DNA测序技术的原理发展和在医学中的应用DNA测序的发展历程Solexa的特点与主要应用Ø读长较短，100－150bpØ通量高Ø主要应用：RNA测序、表观遗传学研究8DNA测

序技术的原理发展和在医学中的应用DNA测序的发展历程SOLiD的特点与主要应用Ø读长较短，50-75bpØ精度高，Ø通量高，Ø主要应用：基因组重测序、SNP检测等9DNA测序技术的原理发展和在医学中的应用DNA测序的发展历程三种第二代测序技术对比10DNA测序技术

的原理发展和在医学中的应用DNA测序的发展历程第三代测序技术第二代测序技术在制备测序文库的时候都需要经过PCR扩增，而这一PCR过程可能引入突变或者改变样品中核酸分子的比例关系。另外，第二代测序的读长普遍偏短，在进行数据拼接时会遇到麻烦。为了克服

这样的缺点，业界发展出了以单分子实时测序和纳米孔为标志的第三代测序技术。11DNA测序技术的原理发展和在医学中的应用DNA测序的发展历程第三代测序技术12DNA测序技术的原理发展和在医学中的应用双脱氧链末端合成终止法1977年，

英国人FrederickSanger创建了双脱氧链末端合成终止法（chainterminationmethod），简称Sanger法、双脱氧法或酶法。他发现如果在DNA复制过程中掺入ddNTP，就会产生一系列末端终止

的DNA链，并能通过电泳按长度分辨。不同末端终止DNA链的长度是由掺入到新合成链上随机位置的ddNTP决定的。双脱氧链末端合成终止法13DNA测序技术的原理发展和在医学中的应用双脱氧链末端合成终止法14DNA测序技术的原理发展和在医学中的应用双脱氧

链末端合成终止法15DNA测序技术的原理发展和在医学中的应用双脱氧链末端合成终止法基本原理是利用DNA聚合酶，以待测单链DNA为模板，以dNTP为底物，设立四种相互独立的测序反应体系，在每个反应体系中加入不同的双脱氧核苷三磷酸（dideoxyribo

nucleosidetriphosphate，ddNTP）作为链延伸终止剂。在测序引物引导下，按照碱基配对原则，每个反应体系中合成一系列长短不一的引物延伸链，通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测

后，从凝胶底部到顶部按5′→3′方向读出新合成链序列，由此推知待测模板链的序列。16DNA测序技术的原理发展和在医学中的应用双脱氧链末端合成终止法测序时分成四个反应,每个反应除上述成分外分别加入2,3-双脱氧的A,C,G,T核苷三磷酸（称为ddATP,ddCTP,ddGTP,ddT

TP）,然后进行聚合反应。在第一个反应中,ddATP会随机地代替dATP参加反应，一旦ddATP加入了新合成的DNA链，由于其第3位的-OH变成了-H,所以不能继续延伸,于是第一个反应中所产生的DNA链都是到A就终止了。具

体操作17DNA测序技术的原理发展和在医学中的应用双脱氧链末端合成终止法18DNA测序技术的原理发展和在医学中的应用双脱氧链末端合成终止法引物Ø在DNA聚合酶催化的测序反应中需要测序引物。不论是单链DNA模

板，还是双链DNA模板，都可通过使用克隆位点两侧的载体序列互补的“通用”引物。Ø通用引物的长度一般为15～30个核苷酸。Ø如果是PCR产物直接测序，也可以用一端的PCR引物19DNA测序技术的原理发展和在医学中的应用双脱氧链末端合成终止法测序酶（sequenase）测序酶是一种经过修

饰的T7噬菌体DNA聚合酶，消除了3′→5′外切酶活性。该酶活性非常稳定，具有很高的链延伸能力和极快的聚合反应速度，是测定较长DNA的首选酶。20DNA测序技术的原理发展和在医学中的应用双脱氧链末端合成终止

法测序产物的凝胶电泳及识读Ø能否将测序反应中产生的各种不同长度的DNA片段进行有效分离是序列分析成败的关键。Ø最早采用放射性标记引物，后来采用荧光剂标记。21DNA测序技术的原理发展和在医学中的应用D

NA序列分析的自动化Ø激光测序法终止标记系统是用4种不同的荧光染料标记不同的ddNTP。Ø测序反应可以在同一反应管内进行，不必分成4管，反应产物按终止位置的碱基不同其3′末端带有不同的荧光基团，被激发后产生不同的荧光，将反应产物加样于凝胶的同一加样孔，电泳分离

后，经过DNA测序仪分析系统识别，将检测将信号不断传送到计算机，通过软件分析，自动读出待测DNA的全部核苷酸序列。22DNA测序技术的原理发展和在医学中的应用DNA序列分析的自动化23DNA测序技术的原理发展和在医学中的应用DNA序列分析的自动化毛细管电泳Ø毛细

管电泳（Capillaryelectrophoresis,CE）是以高压直流电场为驱动力，在毛细管内使荷电粒子按淌度或分配系数进行分离的一种电泳技术。Ø具有分辨率高、重现性好、灵敏度高、快速和易于实现自动化等优点24DNA测序技术的原理发展和在医学中的应用Maxam-Gilbert

DNA化学降解法基本原理：直接或间接特异性识别4种碱基特定化学试剂可对碱基进行特异性修饰在修饰碱基处(5‘或3’)打断磷酸二酯键将一个DNA片段的5'端磷酸基作放射性标记，再分别采用不同的化学方法修饰和裂解特定碱基，从而产生一系列长度不一而5'端被标记的DN

A片段，这些以特定碱基结尾的片段群通过凝胶电泳分离，再经放射线自显影，确定各片段末端碱基，从而得出目的DNA的碱基序列。25DNA测序技术的原理发展和在医学中的应用Maxam-GilbertDNA化学降解法操作步骤①先用限制性内切酶把DNA切成10—20

0bp的测序材料；②用碱性磷酸化酶处理该片段，消除5′末端上的磷酸；③在5′OH端标记32P，用多核苷酸磷酸激酶催化；④标记片段变性为单链；⑤用特异的化学试剂作用于不同的碱基进行修饰，然后用哌啶甲酸切断反应碱基的多核

苷酸链，紧接着用四组不同的特异反应可以使末端标记的DNA分子切成不同长度的片段，产生一组其末端都是该特异碱基的长度不等的DNA片段；⑥经电泳和放射性自显影后，从4个反应系统统一阅读，待测DNA的全部核苷酸序列就可直接读出26D

NA测序技术的原理发展和在医学中的应用Maxam-GilbertDNA化学降解法27DNA测序技术的原理发展和在医学中的应用Maxam-GilbertDNA化学降解法该反应的关键在于使DNA的4种核苷酸中，只有1-2种发生特异性的

化学切割反应：Ø碱基的特异性修饰；Ø修饰的碱基从核糖环上转移；Ø失去碱基的糖环部位发生DNA链断裂。Ø专门用来对核苷酸作化学修饰，并打断磷酸二酯键的化学试剂有硫酸二甲酯（dimethylsulphate)和肼(hydr

azine)、哌啶甲酸等。28DNA测序技术的原理发展和在医学中的应用Maxam-GilbertDNA化学降解法肼，又称联氨NH2.NH2在碱性环境中作用于胞嘧啶C和胸腺嘧啶T的C4和C6位置导致糖苷键断裂。如果加入高浓度的盐（1.5MNaCl），肼则主要作用于胞嘧啶C使之断裂。

在高温强碱作用(90℃,1.2MNaOH)下可使腺嘌呤A位点发生剧烈的断裂反应,但对胞嘧啶C的反应较弱胸腺嘧啶胞嘧啶29DNA测序技术的原理发展和在医学中的应用在4种反应体系中，化学试剂特异地断裂DN

A的机制是：G+A反应----（哌啶）甲酸使嘌呤环上氮原子质子化，削弱了嘌呤脱氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。G反应----硫酸二甲酯（DMS）使GN7甲基化，其后断开了C8-C9间的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合

。T+C反应----肼断开了嘧啶环，产生碱基片段被哌啶置换。C反应----在NaCl存在时，只有C才能与肼发生反应，随后，被修饰的胞嘧啶被哌啶置换。Maxam-GilbertDNA化学降解法31DNA测序技术的原理发展和在医学中的应用Maxam-Gilber

tDNA化学降解法5′—GATCACTACTG—3′标记5′—*GATCACTACTG—3′G：DMSC：肼（加盐）G+A：甲酸C+T：肼5′-*GATCACTACTG5′-*G5′-*GATCACTACTG5′-*GATCACTA

5′-*GATCA5′-*GA5′-*G5′-*GATCACTAC5′-*GATCACT5′-*GATCAC5′-*GATC5′-*GAT5′-*GATCACTACT5-*GATCACTACTG-5′-*GATCACTAC5′-*GATCAC5′-*GATC-*GATC

ACTACTG-32DNA测序技术的原理发展和在医学中的应用Maxam-GilbertDNA化学降解法在化学修饰反应过程中，通过控制反应温度和反应时间，只有一小部分碱基被修饰(而不是全部被修饰)，随后进行的断裂反应也是定量反应。因此，DNA链并不是在所有可被修饰的碱基位点断裂

，而是随机断裂。在4个反应中，产生4套带相同标记末端、长短不一的寡聚核苷酸片段。只有带标记末端的片段可被识别，没有标记末端的片段可以忽略不计。33DNA测序技术的原理发展和在医学中的应用Maxam-Gi

lbertDNA化学降解法34DNA测序技术的原理发展和在医学中的应用Maxam-GilbertDNA化学降解法35DNA测序技术的原理发展和在医学中的应用Maxam-GilbertDNA化学降解法如果G+A中出现1条带就

看G列中是否有同样大小的带，若有即为G碱基，无则为A碱基；同理，C+T中则检查C列中有无同样大小条带，有即为C，无则为T。36DNA测序技术的原理发展和在医学中的应用Maxam-GilbertDNA化学降解法

化学法测序采用32P标记DNA进行，条带会较末端法更模糊，更宽，由于分辨率不足，从单块凝胶上能得到可靠序列数量约为200-300bp以内。37DNA测序技术的原理发展和在医学中的应用Maxam-Gilb

ertDNA化学降解法优点：不需要进行酶催化反应，因此不会产生由于酶催化反应而带来的误差；对未经克隆的DNA片段可以直接测序；化学降解测序法特别适用于测定含有如5-甲基腺嘌呤A或者G，C含量较高的DNA片段，以及短

链的寡核苷酸片段的序列。化学降解测序法既可以标记5'-末端，也可以标记3'-末端。如果从两端分别测定同一条DNA链的核苷酸序列，相互参照测定结果，可以得到准确的DNA链序列。38DNA测序技术的原理发展和在医学中的应用Maxam-Gilbe

rtDNA化学降解法缺点：没有改进,操作繁琐,化学试剂的毒性大,放射性同位素标记效率偏低以致需要较长的放射自显影曝光时间,人工读取数据费时费力.目前,仅在分析特殊DNA链的核苷酸序列和分析DNA和蛋白质相互作用中的DNA一级结构时才使用39DNA测序技术的原理发展和在医学中

的应用DNA测序在医学中的应用在人类疾病基因研究的应用对遗传病的预防和治疗基因诊断基因治疗40DNA测序技术的原理发展和在医学中的应用DNA测序在医学中的应用1986年由美国学者提出的，目前正在实施的

人类基因组计划(humangenomeproject)，则是要通过对人类基因组全序列的序列分析和人类基因的染色体图谱制定达到了解其结构，认识其功能，即从分子遗传学水平来认识人类自身的结构和功能特征的目的。人类

疾病相关的基因是人类基因组中结构和功能完整性至关重要的信息。41DNA测序技术的原理发展和在医学中的应用DNA测序在医学中的应用HGP对人类疾病基因研究的贡献对于单基因病，采用“定位克隆”和“定位候选克隆”的全新思路，利用DNA序列分析技术，导致了亨廷顿舞蹈病

、遗传性结肠癌和乳腺癌等一大批单基因遗传病致病基因的发现。对于心血管疾病、肿瘤、糖尿病、神经精神类疾病（老年性痴呆、精神分裂症）、自身免疫性疾病等多基因疾病是目前疾病基因研究的重点。42DNA测序技术的原理发展和在医学中的应用DNA测

序在医学中的应用基因诊断治疗基因诊断是直接从DNA水平检测人类疾病中的缺陷基因或相关基因。基因诊断可用于对遗传性疾病的诊断、传染性病原体的检测、产前检测以及确定亲缘关系等，如对地中海贫血症、先天愚型、血

友病的诊断等。基因治疗是以基因转移为基础，将某种遗传物质导入患者体内，使其在体内表达并发挥作用，从而达到治疗疾病目的的一种方法。43DNA测序技术的原理发展和在医学中的应用DNA测序在医学中的应用基因治疗将正常外源基因导入动物体靶细胞内，用来弥补缺陷基因，以达到治疗遗传病的

目的。相反，将显性疾病基因导入动物体或敲除某正常基因，使其发生临床症状，制造动物模型。脊肌萎缩症的产前基因诊断44DNA测序技术的原理发展和在医学中的应用DNA测序在医学中的应用血友病的基因治疗目前，血友病系单基因造成的凝血紊乱，基因水平上的发病机制已

较为清楚，如FⅪ基因突变的相关数据库已建立较之以前在血友病相关凝血因子基因、蛋白结构及其功能上的研究。而且，对血友病的治疗科可通过构造动物模型进行，选用体型较大的动物(如狗)。45DNA测序技术的原理发展和在医学中的应用DNA测序在医学中的应用46DNA测序技术的原理发展和在医学中

的应用Thanks47DNA测序技术的原理发展和在医学中的应用